3.4 测定步骤

3.4.1 样液制备

称取10g试样(精确至0.1g)，置于均质杯内，加入40.0 mL丙酮水溶液(3.2.1)，于10000r/min均质5 min。移入带盖的离心管中，于8 000 r/min离心30 min。然后取20.0mL的上清液过滤，滤液作为样液。

3.4.2 菌悬液的制备

将表皮葡萄球菌接种于盛有培养基Ⅱ(3.2.6)的试管内，于(36±1)℃培养17h，经转种3次培养的菌悬液，方可使用。

3.4.3 检定平板的制备

在制平板前，先用吸有0.08 mL的0.25 ug/mL浓度的标准工作液的滤纸片对菌悬液的最佳用量进行预测试。以不同量的菌悬液加入经熔化并冷却至45～50℃的培养基Ⅲ(3.2.7)，经充分混合并经(36±1)℃培养(17±1)h后，选择能使该浓度标准工作液产生直径≥12 mm清晰、完整的抑菌圈的菌悬液用量为最佳用量。

将培养基Ⅲ(3.2.7)熔化并冷却至45～50℃，加入最佳用量的菌悬液，使之充分混匀后，取8 mL注入已灭菌的培养皿内，保持水平，待其凝固制成检定平板。所用平板需当天制备。

3.4.4 标准曲线的制备

以0.5 ug/mL浓度的标准工作液作为参考浓度。标准曲线上的每个标准工作液浓度各取3个检定平板为一组。在每个平板的表面放置6张滤纸片，使滤纸片在半径为2.8 cm的圆面上成60^o角间距。其中3张滤纸片滴加参考浓度溶液，另3张滤纸片滴加其他一种浓度的标准工作液。参考浓度溶液与标准工作液要间隔放置。5个浓度标准工作液共用15个检定平板。含量最低的标准工作液(0.25 ug/mL)的3个检定平板作为判断阴性结果的对照，其他12个检定平板用来绘制标准曲线。这样0.50 ug/mL参考浓度溶液将得出45个抑菌圈直径的数值，而其他浓度的标准工作液将得出各9个抑菌圈的数值。

将陶瓦盖盖好。置36℃培养(17±1)h。翻转平板，除去滤纸片。精确地测量所产生的抑菌圈的直径(精确到0.1mm)。求出每组3个检定一平板上0.5 ug/mL浓度的抑菌圈直径读数与其他浓度标准工作液的抑菌圈直径读数的平均值。再求出参考浓度(0.5 ug/mL)的所有45个抑菌圈直径数值的一平均值。用45个参考浓度抑菌圈直径的平均值与每组中9个参考浓度抑菌圈直径平均值之差来校正其他各浓度标准工作液的抑菌圈读数的平均值。

将校正后的值，用式(1),(2)算出L和H。在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标(算术级)，以浓度(ug/mL)为横坐标(对数级)，标出L和H点。通过L和H点连一直线即为标准曲线。

L＝(3a＋2b＋c-e)/5······(1)

H=(3e＋2d+c-a)/5······(2)

式中：L—标准曲线上的最低浓度(0.25ug/mL)抑菌圈直径，mm;

H—标准曲线上的最高浓度(4.0ug/mL)抑菌圈直径，mm;

c—参考浓度0.5 ug/mL的45个抑菌圈直径的平均值，mm;

a,b,d,e—分别表示标准曲线中其他浓度标准工作液(0.25、0.1、2.0、4.0 ug/mL)的抑菌圈直径经校正后的平均值，mm。

3.4.5 样液的测定

每份样液用三个检定平板。取6张滤纸片，用微量注射器分别吸取0.08 mL样液滴加于其中3张滤纸片上，其余3张则分别滴加0.08 mL浓度为0.5 ug/mL的标准工作液，间隔放于同一检定平板上，使滤纸片在半径为2.8cm的圆面上成60℃角间距，轻轻压实，盖上陶瓦盖。于4℃放置(1±0.5) h后，在(36±1)℃下培养(17±1)h。

去盖，除去滤纸片，如有抑菌圈产生，精确测量其直径。经校正后，求出其平均值。

3.5 结果的计算和表述

如样液呈现抑菌圈直径＜12 mm，即报告为“阴性”。

抑菌圈的直径≥12mm，经校正后，从标准曲线上查出相应的新生霉素的浓度。再用式(3)计算试样中新生霉素残留的含量。

式中：X—试样中新生霉素残留的含量,mg/kg；

c—丛标准曲线上查出的最终样液中新生霉素浓度，ug/mL；

m—最终样液所代表的试样量浓度，g/mL。

注：如测定结果呈阳性．即所显抑菌圈的平均直径≥12 mm，必要时，尚需进行确证试验，以证明抑菌物确系新生霉素。

4 测定低限和回收率

4.1 测定低限

本方法的测定低限为1.0 mg/kg。

4.2 回收率

鸡肉中新生霉素的添加浓度及其回收率的实验数据：

1.0 mg/kg时，回收率为76.9%;

2.0 mg/kg时，回收率为86.3%;

4.0 mg/kg时，回收率为88.5%。

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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