7 测定步骤

7.1 提取

称取6g试样(精确到0.01g)置于50 ml、具塞玻璃离心管中，加入6 mL水，在液体混匀器上混匀，加20 mL乙酸乙酯，于振荡器上振荡20 min，离心，取上清液至梨形瓶中。再用20 mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液，用旋转蒸发器于45℃水浴上减压蒸发至干，用5 mL水溶解，待净化。

7.2 净化

将上述5 mL水溶液移至Oasis HLB柱中，以小于等于3 mL/min的流速通过Oasis固相萃取柱后，用5 mL水洗涤梨形瓶，移至Oasis HLB柱中洗柱，再用5 mL甲醇＋水(4.6)洗柱，弃去全部流出液。在65 kPa的负压下，减压抽干20 min，将Oasis HLB柱下接Carboxylic Acid固相萃取柱，用5 mL乙酸乙酯以小于等干3 mL/min的流速洗脱Oasis HLB柱并通过Carboxylic Acid固相萃取柱，弃去Oasis HLB柱，分别用5 mL乙酸乙酯和5 mL乙腈洗涤Carboxylic Acid固相萃取柱，弃去全部流出液。在65 kPa的负压下，减压抽干5 min，用2 mL洗脱剂(4.8)洗脱，收集洗脱液于5 mL样品管中，用洗脱剂定容至2 mL，供液相色谱仪测定。

7.3 测定

7.3.1 液相色谱条件

a)色谱柱：Diamosil C₁₈,5 um,250 mm×4.6 mm(内径)或相当者，

b)流动相：乙腈＋乙酸盐缓冲溶液(10+90);

c)流速：10 mL/min;

d)柱温:25℃；

e)进样量：50uL;

f)检测波长：315 nm。

7.3.2 液相色谱测定

用甲硝哒唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑混合标准溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中甲硝哒唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的响应值均应在仪器测定的线性范围内。甲硝哒唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的参考保留时间见表1。

表1 甲硝哒唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的参考保留时间

7.4 平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

7.5 空白试验

除不称取试样外，均按上述步骤同时完成空白试验。

8 结果计算

结果按式(1)计算：

式中：

X—试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克(mg/kg);

c—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为微克每毫升(ug/mL) ;

V一样品溶液最终定容体积，单位为毫升(mL);

m—样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。

注：计算结果应扣除空白值。

9 精密度

本部分的精密度数据是按照GB/T 6379的规定确定的，重复性和再现性的值95％可信度来计算。

9.1 重复性

在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限(r) ,蜂蜜中甲硝哒唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑含量范围及重复性方程见表2。

表2 含量范围及重复性和再现性方程

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

9.2 再现性

在再现性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限(R)，蜂蜜中甲硝哒唑、洛硝哒唑、二甲硝咪唑的含量范围及再现性方程见表2。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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