在有氧条件下葡萄糖氧化酶(GOD)催化β-D-葡萄糖(葡萄糖水溶液状态)氧化，生成D一葡萄糖酸一δ内酯和过氧化氢。受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4氨基安替吡啉和苯酚生成红色醌亚胺，在波长505nm处测定醌亚胺的吸光值，可计算出食品中葡萄糖的含量。

GOD
C₆H₁₂O₆+O₂———C₆H10O6+H2O2
POD
H2O2+C6H5OH+C11H13N3O----C6H5NO+H2O

1．样品处理

(1)不含蛋白质的样品 1～10g样品(精确至O.001g)置于100mL烧杯中，加少量重蒸馏水，移至250mL。容量瓶中，稀释定容，摇匀后用快速滤纸过滤，弃去最初滤液30mL，收集滤液待测。

(2)含蛋白质的试样 l～10g样品(精确至0.001g)置于100mL烧杯中，加少量重蒸馏水，移至250mL容量瓶中，加入O.085mol／L亚铁氰化钾溶液5mL、O.25mol／L硫酸锌溶液5ml和O．25mol／L氢氧化钠溶液10mL，用重蒸馏水定容，摇匀后用快速滤纸过滤，弃去最初滤液30mL，收集滤液待测。

2．试液吸光度的测定

用微量移液管吸取O.50～5.OOmL试液(依试液中葡萄糖的含量而定)，置于10mL比色管中，加入3mL酶试剂溶液，摇匀，在(36±1)℃的水浴锅中恒温40min，冷却至室温，用重蒸馏水定容至10mL，摇匀，用1cm比色皿，以等量试液调整分光光度计的零点，在波长505nm处，测定溶液的吸光值。

3．标准曲线的绘制

移取0、O.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.OOmL葡萄糖标准溶液，分别置于10mL比色管中，各加入3mL酶试剂溶液，摇匀，在(36±1)℃的水浴锅中恒温40min。冷却至室温，用重蒸馏水定容至10mL，摇匀，用1cm比色皿，以葡萄糖标准溶液含量为0的试剂溶液调零点，在波长505nm处，测定各比色管中溶液的吸光值，然后以葡萄糖含量为纵坐标，吸光值为横坐标，绘制标准曲线。

4．结果计算

X=C/m*v2/v1*1/1000*1000*100

式中X——样品中还原糖的含量，g／100g；
c----标准曲线上查出的试液中葡萄糖的含量，μg；
m——试样的质量，g；
Vl——试液的定容体积，mL；
V2——测定时吸取试液的体积，mL。

5．试剂

(1)组合试剂盒

①1号瓶：内含0.2 mol／L磷酸盐缓冲溶液(pH=7)100mL，其中4一氨基安替吡啉为 O．00154mol／L。
②2号瓶：内含O.022mol／L苯酚溶液100ml。
③3号瓶：内含葡萄糖氧化酶400U(活力单位)、过氧化物酶1000U(活力单位)。

1～3号瓶须在4℃左右保存。

(2)酶试剂溶液 将1号瓶和2号瓶内容物混合均匀，再将3号瓶的物质溶解其中，轻轻摇动(勿剧烈摇动)，使葡萄糖氧化酶和过氧化酶完全溶解，此溶液须在4℃左右保存,有效期1个月。

(3)0.085mol／L亚铁氰化钾溶液 称取3.7g亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]，溶于100ml重蒸馏水中，摇匀。

(4)0.25mol／L硫酸锌溶液 称取7.7g硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，溶于100mL重蒸馏水中，摇匀。

(5)氢氧化钠溶液 0.1mol／L。

(6)葡萄糖标准溶液 称取经(100±2)℃烘烤2h的葡萄糖1．0000g，溶于重蒸馏水中，定容至100mL，摇匀，将此溶液2mL用重蒸馏水稀释至lOOmL，即为200μg／mL葡萄糖标准溶液。

6．仪器

①恒温水浴锅。

②可见光分光光度计。

7．注意事项

①本方法为仲裁法，由于本方法中使用的葡萄糖氧化酶(GOD)具有专一性，只能催化葡萄糖水溶液中β-D葡萄糖被氧化，因此测定结果比直接滴定法和高锰酸钾滴定法准确,适用于各类食品中葡萄糖的测定，也适合于食品中其他组分转化为葡萄糖的测定，其最低检测限量为0．01μg／mL。

②本方法对使用的各种酶的活力有严格的技术要求。

葡萄糖氧化酶酶活力(U／mg)≥20g。

过氧化物酶酶活力(U／mg)≥50g。

葡萄糖氧化酶和过氧化物酶中不得含有纤维素酶、淀粉葡萄糖苷酶、β一果糖苷酶、半乳糖苷酶和过氧化氢酶。

酶活力的检验方法：吸取0.50mL葡萄糖标准溶液，置于10mL比色管中，加入100／μg 可溶性淀粉、100μg纤维二糖(生化试剂)、100μg乳糖和100μg蔗糖，再加入3ml。酶试剂溶液，摇匀，置于在(36±1)℃的水浴锅中恒温40min。冷却至室温，用重蒸馏水定容至40mL摇匀，用1cm比色皿，以葡萄糖标准溶液含量为0的试剂溶液调整分光光度计的零点，在波长505nm处，测定比色管中溶液的吸光值。测定吸光值后，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算葡萄糖的回收率。

F=c/0.5*200*100

式中 F——葡萄糖的回收率，％；
c——葡萄糖含量的实测值，μg。

若测得葡萄糖的回收率在95％～105％，则判定葡萄糖氧化酶和过氧化物酶符合要求。

③样品处理中，如果试液中葡萄糖含量大于：300μg／mL时，应适当增加定容体积。