41. HPLC中产生色谱峰扩展的主要因素是什么？如何减少谱带扩张？

答：HPLC中引起色谱峰扩展的主要因素是涡流扩散、流动相的流速过小、柱外效应等。在HPLC中，要减小色谱峰扩展或减少峰变形，可以采用提高柱效、增加流动相的流速、采用提高检测器灵敏度的量程等办法。还可以用减少填料颗粒直径，减小填料孔穴深度，提高装填的均匀性，采用低黏度溶剂作流动相。流动相的流速尽可能低，同时要尽可能采用死体积较小的进样器、检测器(流动池)、接头和传输管线等。

42. HPLC的流动相为什么要预先脱气？常用的脱气方法有哪几种？

答：HPLC的流动相中溶解气体后，存在以下几个方面的害处：气泡进入检测器，引起光吸收变化(电信号的变化)，基线突然跳动，出异常峰、干扰检测正常工作；溶解在溶剂中的气体进入色谱柱时，可能与流动相或固定相发生化学反应；溶解气体还会引起某些样品的氧化降解，给分离和分析结果带来误差，严重时还会引起色谱柱损坏。因此，使用前必须对流动相进行脱气处理。

常用的脱气法有以下几种：①加热脱气法；②抽吸脱气法；③吹氦脱气法；④超声波振荡脱气法。最常用、最简单的是抽吸脱气法和超声波振荡脱气法。

43. HPLC的色谱柱有哪几种类型？细径柱有什么优点？

答：HPLC色谱柱大致可分为三种类型：内径小于2mm的称为细管径或微管径柱；内径在2～5mm范围内的是常规高效液相色谱柱；内径大于5mm的一般称为半制备柱或制备柱。细管径柱的主要优点是：①分离效能高；②流动相最佳流速低，消耗量少；③可采用多种检测器，便于联用(LC-MS, LGFTIR等)；④采用细而短的毛细管柱可以提高分析速度，实现快速分析。

44．对 HPLC的流动相有哪些基本要求？

答：用作液相色谱流动相的溶剂，其纯度和化学特性必须满足色谱过程中稳定性和重复性的要求。对样品要有一定的溶解能力，黏度小，化学稳定性好，避免发生不可逆的化学吸附。溶剂应与检测器相匹配，不干涉所使用检测器的工作，制备色谱的溶剂应不干扰对分离各组分的回收。除此以外，选择的溶剂要对所给定的样品组分具有合适的极性和良好的选择性，还要具有合适的pH。

概括起来说，我们平日用作HPLC流动相的溶剂，一般至少应该有以下五个基本特点：①价格比较便宜，最好毒性较小；②其纯度和化学特性必须满足色谱过程中稳定性和重复性的要求；③对样品要有一定的溶解能力，并且黏度要小，化学稳定性要好，避免发生不可逆的化学吸附；④溶剂应与检测器相匹配，不干涉所使用检测器的工作，制备色谱的溶剂应不干扰对分离各组分的回收；⑤选择的溶剂对所给定的样品组分具有合适的极性和良好的选择性。

45．在硅胶柱上，用甲苯做流动相，某组分的保留时间为30min；如果改用四氯化碳或乙醚做流动相，哪一种溶剂可以减少该组分的保留时间？为什么？

答：该体系是一种正向色谱体系。在该体系中流动相的极性增大时，保留时间的值会减小，而流动相甲苯、四氯化碳和乙醚的溶剂强度参数分别是0.29、0.18、0.38,因此，选用溶剂强度参数大于甲苯的乙醚，可缩短该化合物的保留时间；但是具体能缩短多少保留时间，还应该考虑流动相的流速等因素。

46．在HPLC中，组分和溶剂分子之间存在哪几种作用力？

答：色谱理论告诉我们：在HPLC中，组分和溶剂之间存在色散力作用、偶极作用、氢键作用和介电作用等四种作用力。

47．什么是溶剂极性参数与溶剂强度？它们之间的关系如何？

答：我们把溶剂分子与溶质分子以色散力、偶极作用力、氢键作用力及介电作用力四种方式进行相互作用的能力称为分子的“极性”。溶剂的这种相互作用的能力以溶剂极性参数表示，溶剂极性参数值越大，溶剂的极性就越强。

溶剂强度是指用作流动相的溶剂将组分从色谱柱上洗脱下来的能力，溶剂强度与溶剂的极性直接相关，而且随不同色谱体系改变。一般来讲，在正相色谱体系中，溶剂极性(P')增加，使组分从柱上洗脱下来的能力增加，即溶剂极性参数(P')越大的溶剂，溶剂强度越大。在反相色谱中，溶剂极性减小，使组分从柱上洗脱下来的能力增加，即溶剂极性参数(P')越小的溶剂，溶剂强度越大。

48．在正相色谱与反相色谱体系中，一般组分的出峰次序如何？

答：流动相的极性比固定相的极性强的色谱体系叫反相色谱，例如以十八烷基硅胶键合相(ODS)为固定相，以甲醇/水作流动相，是典型的反相色谱。流动相的极性比固定相的极性弱的色谱体系叫正相色谱。在正相色谱体系中组分的出峰次序为：极性弱的组分，在流动相中溶解度较大，因此分配系数k值小，先出峰。极性强的组分，在固定相中的溶解度较大，因此分配系数k值大，后出峰。

在反相色谱中组分的出峰次序为：极性弱的组分在固定相上的溶解度大，分配系数k值大，后出峰，相反极性强的组分在流动相中溶解度大，k值小，所以先出峰。

49．在ODS固定相上，以甲醇为流动相。某组分的分配容量k=1.2，如以乙腈为流动相，其k增加还是减少？为什么？

答：在ODS固定相上，如将以甲醇为流动相改为乙腈为流动相，其k值肯定是增加了。因为在反相色谱体系中，流动相由甲醇变为乙腈，溶剂极性参数由5.1变为5.8；但组分在流动相中的溶解度反而减小，所以k值增大了，由1.2增大为2.24。

50．什么叫离子色谱？

答：在低交换容量的分离柱上分离样品离子，而在高交换容量的抑制柱上，通过化学反应，把具有高电导的流动相转变为低电导的流动相，这样就可以在电导检测器上对被分离样品离子进行高灵敏度的检测。这种采用分离柱、抑制柱和电导检测器相结合的离子交换色谱称为离子色谱。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（四）