51．为什么凝胶色谱中任何组分的分配系数必须符合O≤K≤1?如果K>1说明什么问题？

答：因为组分的分配系数为K=C_s/C_m(C_s与C_m分别为组分在固定相和流动相中的浓度)，当分子直径大于固定相孔径时，此时C_m＝0，所以K=0。当分子直径小于孔径时，组分向孔隙内流动相扩散，达到平衡时，一半组分在孔隙内，一半在孔隙外，此时K=1.0,若分子直径介于以上两种极限情况之间，K一定介于0与1之间。可见在凝胶色谱中，任何组分的分配系数为0≤K≤1。如果K>1，则说明此时的分离方式已经不是纯粹的凝胶色谱，其分离过程受到其他作用力(如吸附)的支配。

52．某人用凝胶色谱分离一高聚物样品，分离情况很差，他改变流动相的组成后。分离情况大为改进，这种做法对吗？为什么？

答：在凝胶色谱中，流动相只起运载的作用，不能依靠改变流动相的性质和组成来改善色谱体系的选择性。凝胶色谱的选择性只能通过选择合适的固定相，根据固定相孔隙的大小以及孔径分布范围的最佳化来实现。所以，通过改变流动相组成改进分离情况的做法是不对的。

53. HPLC仪器能正常启动，能排空，指示灯也亮，但是不能正常运行，为什么？

答：这类问题，可以从以下几个方面考虑解决。

(1)检查贮液瓶是否清洁，及时更换。

(2)定期(如半个月)在稀硝酸溶液中超声、清洗过滤器，保持过滤器畅通无阻。

(3)珍惜保护色谱柱，避免柱头突然产生大的波动，扰动损伤柱床。如避免泵启动过速、升压过快、样品阀搬动过慢所造成的柱压大的波动。

(4)采用保护(警戒)柱，延长柱寿命。如污染物堆积于保护柱柱头，造成柱压升高、柱效下降、峰形变差时，卸下用强溶剂反冲后再用或更换新保护柱。

(5)经常用强溶剂冲洗柱子，将柱内强保留组分及时洗脱出。反相柱用异丙醇-二氯甲烷(1:1)冲洗，正相(硅胶柱)用纯甲醇或异丙醇冲洗，时间均不少于1h。

(6)做完试验，及时用适当溶剂冲洗柱子和进样阀，尤其是对隔夜的柱子和进样阀，一定要用足量的水彻底洗净其中的盐类、缓冲液，再用甲醇或乙腈冲洗，并保存在乙腈中：正相柱保存在非极性有机溶剂(如己烷)中。

(7)尽量用流动相溶解样品，一是避免出现拖尾峰、怪峰，二是避免试样在系统中由于溶解度降低而析出。

(8)对于阻塞或受伤严重的柱子，必要时可卸下不锈钢滤板，超声洗去滤板阻塞物，对塌陷污染的柱床进行清除、填充、修补工作，此举可使柱效恢复到一定程度(80％)，有继续使用的价值。

(9)用HPLC分析酸碱性物质，由于吸附作用(次级保留)使峰开拖尾。加入改良剂可以大大改善峰形，提高积分的准确度。一般规则是：①分析酸性物质，可加入1％有醋酸；②分析碱性物质，可加入10～20mmol/L三乙胺；③酸碱物质混为一体，可同时加入1％的醋酸和10～20mmol/L三乙胺。

54．采用0.1M的氨水：乙腈作流动相测尼古丁时重现性差，经查资料是由于氨水容易挥发，见光受热时容易分解。请问有没有其他试剂可以替代氨水来检测尼古丁？

答：使用氨水检测尼古丁不妥；我们一般用三乙胺或缓冲盐替代。下面介绍有关科技工作者采用过的两种检测尼古丁的方法。

(1)环境空气中尼古丁的HPLC测定方法。①流动相的制备：准确称取1.09g磷酸二氢钾，用超纯水溶解至接近于1L，用磷酸调节pH为3，定容至1L，准确加入0.0082g庚烷磺酸钠，混匀，通过0.45um过滤膜过滤，制得的磷酸二氢钾溶液与乙腈比例为9：1,混匀待用；②色谱条件：色谱柱可采用C18柱(150×4.6mm)，柱温为25℃左右，SPD检测器，检测波长为260nm，流动相流速为1mL/min。

(2)有科技工作者问：如何用液相微萃取HPLC法，快速测定唾液中尼古丁的含量？作者建议；①色谱条件：采用紫外检测器，检测波长为254nm;②色谱柱：C18(4.6×250mm) ;③流动相：10mmol/L KH₂PO₄＋甲醇＋三乙胺(90:10:0.1,WV)，以浓H₃PO₄调pH=2.5;④流动相流速：0.6mL/min;⑤柱温：室温(约25℃);⑥进样量：4uL。通过以上方法，大致就可以解决问题。

55．用HPLC进行分析时保留时间有时发生漂移，有时发生快速变化，原因何在？如何解决？

答：(1)关于保留时间漂移问题：首先应搞清楚影响漂移的原因。一般保留时间产生漂移，主要原因有以下几个方面：①仪器使用的环境温度变化大；解决方法是采用柱温箱装置，保持柱温恒定。②高压泵流速发生变化；解决方法是查看流动相的流速是否稳定，如果流动相发生变化，应解决高压泵的稳定性。③流动相发生蒸发、化学反应等。④色谱柱未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡。

(2)关于保留时间快速变化问题，原因可能是：①流速发生变化；解决办法是重新设定流速，使之保持稳定。②泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。③流动相不合适，解决办法为改换流动相。

56. HPLC在使用较长时间后出现峰拖尾，其原因是什么？如何解决？

答：使用一段时间后，HPLC出现峰拖尾的主要原因大致是：①筛板堵塞或色谱柱失效；解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。②系统存在干扰峰；解决办法是使用较长的色谱柱，改换流动相或更换选择性好的色谱柱。③系统漏液；解决办法是检查漏液点并解决之。

57. HPLC灵敏度不够的主要原因是什么？如何解决？

答: HPLC分析检测工作中，很多分析工作者经常会碰到仪器的灵敏度不够(或下降)，作者也是如此。产生这种现象的主要原因大致是：①样品太稀，样品的浓度或样品的量低于检测器的检测限；解决办法是增加样品浓度或样品的量。②样品未从色谱柱子中流出(漏液)；解决办法是查找漏液点并解决之。③流动相的组成或流动相的pH不合适；解决办法是根据样品的化学性质改变流动相组成或重调pH。④色谱柱寿命到期；解决办法是调换新色谱柱。⑤样品与检测器不匹配；解决办法是根据样品化学性质调整检测器的测试波长或改换检测器。⑥检测器量程不对(太大)；解决办法是调整量程、减少衰减。⑦检测器的时间常数太小；解决办法是增大时间参数。⑧检测器流动池的窗片污染；解决办法是清洗流动池，必要时拆下流动池窗片进行清洗。⑨HPLC的检测器的检测限太高，仪器本身灵敏度不够；解决办法是寻找检测限低的检测器取而代之。⑩HPLC系统(特别是检测器)的噪声太大，仪器的信噪比太小；解决办法是降低噪声(特别是降低检测器的噪声)，提高灵敏度。⑩检测器流动池中有气泡；解决办法为采用大流量排气。⑩流动相的流量不合适；解决办法是调整流速。

58．做HPLC分析检测时，色谱柱压不稳定，原因何在？如何解决？

答：HPLC使用过程中，经常会碰到色谱柱压力不稳定，其原因可能有：①高压泵内有空气；解决办法是清除高压泵内的空气、对流动相进行脱气处理。②比例阀失效；解决办法是更换比例阀。③高压泵密封垫损坏；解决办法是更换密封垫。④流动相中有气泡；解决办法是对流动相脱气，必要时改变脱气方法。⑤系统漏液；找出漏点，密封即可。⑥梯度洗脱时色谱柱压力波动；梯度洗脱时色谱柱压力波动是正常的，不必处理。

59．有一种牌号的ODS柱，虽然分离情况可以，但保留时间不能重现，为什么？如何解决这个问题？

答：这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用，因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。

解决办法：在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺(TEA)，将会使硅醇基的成键能力饱和，从而保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。

60．购买的新色谱柱验收测试时柱压过高，为什么？

答：HPLC新色谱柱的柱压过高是用户最常碰到的问题。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，一般可按下面步骤检查问题的起因：①拆去保护柱，看柱压是否还高，以确认是否是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查。②把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，若是管路堵塞，则需清洗管道解决；若压力下降，再检查其他部位。③将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子(此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动性)。如果柱压仍不下降，再检查其他部位。④更换色谱柱入口筛板，若柱压下降，说明溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。若柱压还高，请与厂商联系。一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的Rheod-yne 7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（五）