31. HPLC的移动相为什么要过滤？

答：溶剂进泵前和样品注入前，应该过滤除去溶剂中的微小颗粒、微生物，保证泵和色谱柱不会沾污、堵塞或损坏，保证分析数据可靠。

一般来讲，HPLC的使用者应该重视过滤器和其最佳孔径选择的方法。可以这样说，所有进入色谱柱的溶液(试剂)，都必须脱气和过滤。对过滤器总的要求是：速度快、溶出度小、死体积小、孔径精确、体积适当、化学兼容性好等。
过滤器最佳孔径选择方法：如果色谱柱填料直径小于3um或除菌过滤，一般选择0.2um孔径；如果色谱柱填料直径大于5um，则选0.45 um；如果是预过滤或较难过滤的样品，一般选1 um孔径。特别是对使用无机盐配制的缓冲液，更要注意选择合适的过滤器，否则，色谱柱等就会被沾污，就不可能得到可靠的分析测试数据。

32. HPLC峰拖尾的原因何在？一般如何解决峰拖尾的问题？

答：这个问题很常见。为什么会产生测试峰拖尾？如果是色谱柱沾污、柱效下降或柱被损坏，通过洗色谱柱或换新色谱柱解决；进样太多或柱超载，通过减少进样量解决；溶剂的pH不合适，通过调节流动相的pH解决。分析碱性化合物时，碱性化合物的峰拖尾可能是硅胶表面存在的酸性硅醇基引起的，在流动相中加入三乙胺可以解决；分析酸性化合物时，在流动相中加入三氟乙酸或乙酸可以解决。如果是因为试样太稀产生拖尾(经常会碰到此类峰拖尾)，可以改用浓度大一点的试样，很快就可解决。

另外也有可能是色谱柱接头处产生漏液引起的峰拖尾，应该仔细检查色谱柱的质量和接头处是否漏液。还有，HPLC系统的检测器的故障或流动池沾污、高压泵出现故障、进样器被沾污等都会引起峰拖尾。总之，HPLC的峰拖尾是一个比较复杂的问题，有时需要仔细检查整个HPLC系统的各个部分才能解决。

33．什么叫HPLC的光学分辨率和色谱分辨率？重要性何在？

答：HPLC的光学分辨率指的是HPLC的光学类检测器的分辨率，它取决于单色器的光谱带宽(与单色器的出射狭缝几何宽度成正比)；色谱分辨率是指HPLC的色谱柱的分辨率，它与色谱柱的塔板数有关(成正比)。一般来讲，HPLC的光学分辨率不大重要，但是带有停泵扫描的HPLC系统，其光学分辨率还是很重要的，它决定某个含有多个组分的每两个相邻的峰分开的程度。而色谱分辨率是HPLC一项很重要的指标。它决定样品两个相邻的色谱峰能否分开和分开的程度。色谱分辨率主要取决于色谱柱的质量和流动相(组成、pH、流速等)。

34．高压泵、色谱柱、检测器三者哪个最重要？

答：从仪器学理论来讲，只有将HPLC的高压泵、色谱柱、检测器三者(三个部件)结合起来组成一个系统才能叫HPLC；三者都合格，联机后的整机系统才有可能合格，但不能肯定该HPLC系统就一定合格。只有高压泵、色谱柱、检测器三者质量都合格，并且三者联机后检测整个系统的结果也合格，才能说明这台HPLC系统是合格的。所以，研发者、使用者和维修者在处理部件和整机关系时，不能偏重哪一方面，不能盲目地讲三者中谁是核心、谁最重要。目前，光谱、色谱工作者都经常从不同角度使用HPLC系统的部件。例如，色谱工作者经常把光谱仪器(如紫外可见分光光度计、原子吸收分光光度计等)作为HPLC系统的检测器使用，他们说高压泵和色谱柱是最重要的，光谱仪器只是一个检测器而已；而光谱工作者则经常把HPLC的高压泵和色谱柱作为分离工具，他们说高压泵和色谱柱只是一个分离手段，而光谱仪器是最重要的。对此，人们看法都各不相同、各有表述。作者认为，我们不必去追究这些表述；从仪器学理论角度来讲，正确的说法应该是三者缺一不可，都很重要。

35. HPLC是如何实现高效、快速、灵敏的？

答：色谱理论和技术上的成就，为液相色谱的发展创造了条件。从气相色谱的高效、高速和高灵敏得到启发，HPLC采用提高柱效，采用高压泵加快流动相流动的流速，同时设计高灵敏度、低噪声、低漂移、死体积小的紫外、荧光等检测器，提高检测灵敏度，克服经典液相色谱法的缺点，从而达到实现高效、快速、高灵敏度的目的。特别是超高压液相色谱、高效微流电色谱仪器，采用超微型的色谱柱填料、超高压泵和电动色谱来实现超高效的检测，效果非常明显。

36．何谓HPLC的梯度淋洗？它适用于哪些样品的分析？

答：梯度淋洗就是在分离过程中，让流动相的组成、极性、pH等按设定程序连续变化，使样品中各组分能在最佳的分离效率(K)下出峰，使保留时间短、杂乱无章甚至重叠的组分、保留时间过长而峰形扁平的组分获得很好的分离。梯度淋洗特别适合样品中组分的k值范围很宽的复杂样品的分析，所以，在各种复杂体系的分离(特别是中药、生命科学、食品科学等)和分析工作中，梯度淋洗具有非常重要的意义。

37. HPLC的梯度淋洗与气相色谱的程序升温有什么不同？

答：梯度淋洗十分类似气相色谱的程序升温，两者的目的相同，都是为了提高分离效果，更好地分离分析复杂的多组分样品。所不同的是，程序升温是通过程序改变柱温达到样品更好分离的目的，适用于气相色谱的气相样品分析，只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物。而HPLC的梯度淋洗是通过改变流动相组成、极性、pH来达到改变k值(分离效率)的目的，适用于HPLC的液相样品分析。

38．按固定相孔径大小分类，HPLC固定相有哪几类？各有什么特性及适用范围如何？

答：这个问题我们可以从固定相的孔隙深度考虑。高效液相色谱固定相分为表面多孔型(薄壳型)和全多孔型(全孔型)两类。表面多孔型的固定相多孔层厚度小、孔浅、相对死体积小、出峰迅速、柱效高、颗粒较大、渗透性好。由于孔浅，梯度淋洗时，当流动相成分改变后，孔内外流动相成分能迅速达到平衡。同时其还具有机械强度高、装柱容易等优点。其不足之处是由于多孔层厚度小导致柱容量小，最大允许样品量受到限制，只适用于比较简单的样品分析及快速分析。

全多孔型固定相，由于颗粒很细、孔很浅、柱效高，梯度淋洗时孔内外流动相成分的平衡速度仍然较快。其最大特点是柱容A大，最大允许样品量是表面多孔型的5倍左右，但装填的填料一般渗透性较低，因而需要高的操作压力，装柱比表面多孔型难。这种固定相特别有利于痕量组分及多组分复杂混合物的分离分析。

39．与气相色谱法相比，HPLC有哪些优点和不足？

答：众所周知，气相色谱的分析对象只限于分析气体和沸点低的化合物或挥发性的衍生物，而HPLC由于以液体作为流动相，只要被分析的物质在选用的流动相中能产生键合作用便可以分析，所以适用性广，不受样品挥发性和热稳定性的限制。后者特别适合于对那些沸点高、极性强、热稳定性差的化合物，例如生化物质和药物、离子型化合物、热稳定性差的天然产物等。在目前已知的有机化合物中，只有20％左右的样品可不经化学处理而能方便地用气相色谱分离，80％的有机化合物要用HPLC分析。所以，HPLC和气相色谱的使用覆盖面之比为80：20。

在气相色谱中流动相是惰性的气体，它对组分没有作用力，仅起运载作用；而HPLC的流动相不仅起运载作用，而且流动相对组分有一定亲和力，可以通过改变流动相种类和组成提高分离的选择性，另外可作流动相的化合物较多，选择余地广。

HPLC与气相色谱相比，它的另一个优点是样品的回收比较容易，只要将容器放在色谱柱的末端，就可以很容易地将所分离的各组分收集，并且可以实现定量回收，可以用来提纯和制备具有足够纯度的单一物质。

二者相比，HPLC的不足是目前检测器的灵敏度不及气相色谱。使用时还必须要特别注意柱外效应对柱效率及色谱分离效果的影响等。

40．气相色谱与液相色谱的输出曲线有何不同？产生不同的原因何在？

气相色谱和液相色谱得到的HU曲线(H为塔板高度，U为流动相在色谱柱内的线速度的流速)形状不同，流动相的流速对柱效的影响也不一样，在气相色谱的H-U曲线上，塔板高度H随U变化呈双曲线。曲线有一最低点，这时柱效最高，塔板高最小，流速最佳。而HPLC的H-U曲线未出现流速降低塔板高增加的现象，由于最佳流速趋近于零，一般观察不到最低塔板高H相对应的最佳流速。在正常的情况下，流速降低，塔板高H总是降低的，这与气相色谱明显不同。在气相色谱中流动相流速增大，柱效呈直线降低，而在HPLC中，流动相流速增大，色谱柱的柱效平稳降低。产生这些不同的主要原因是HPLC的流动相为液体，HPLC中液相的扩散系数很小，通常仅为气相色谱中气相扩散系数的万分之一或十万分之一，所以分子扩散项在低U时也不起多大作用。因此HPLC的HU曲线未能出现流速降低、塔板高数增加的现象。到高速时，虽然柱内线速度提高，但固定相和流动相的传质都能很快进行，故H-U曲线上升缓慢。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（三）