21．为什么HPLC的荧光检测器的灵敏度会比紫外检测器的灵敏度高很多？

答：从仪器学理论讲，HPLC的紫外检测器的光电转换器在接收样品吸收后的光前，是亮背景(接收的是参比光的照射)，即光电转换器在接收样品光信号前，始终处在一种较强的光信号(参比光信号)照射下；当样品进入流动池后，光电转换器接收的光信号变小，即紫外检测器的光电变换器接收的信号是样品信号。而HPLC的荧光检测器的光电转换器在接收样品的光信号前，是暗背景(没有光信号照射)，即光电转换器在接收样品光信号前，始终处在暗背景的情况下；当样品进入流动池后，由于产生荧光发射，荧光检测器的光电转换器接收到荧光信号，即荧光检测器的光电变换器接收的信号由暗变到样品发射的光信号。所以，HPLC的荧光检测器的灵敏度比紫外检测器的灵敏度高要1000倍左右。

22．什么叫HPLC的选择性检测器和非选择性检测器？哪一种类型的检测器更好？

答：所谓选择性检测器就是该检测器对被检测的样品有选择性，它不是对所有样品都能检测。如HPLC的紫外可见检测器，就只能对某些有紫外光吸收或可见光吸收的样品才能检测；如果样品对紫外光或可见光没有吸收，就不能检测。荧光检测器就只能对样品吸收了激发光后能发荧光的样品或进行衍生后能发荧光的样品才能进行检测。一般来讲，光吸收类的HPLC光学检测器或者说是HPLC的光发射性检测器，都属于选择性检测器；而非选择性的检测器，是指该检测器原则上对所有样品能检测。例如示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电喷雾检测器(Corona®CAD),

质谱检测器等就是非选择性检测器，因为所有有折射率的样品(任何物质都有折射率)，都可以用示差折光检测器检测，所以它是非选择性检测器，或者说是通用性检测器。所有能变成粒子并具有光散射的样品(基本上所有物质或样品都能通过各种方法变成光散射的粒子)，都能用蒸发光散射检测器检测，所以它叫作非选择性的检测器或通用性检测器。电喷雾检测器(Corona®CAD)也是将色谱洗脱液雾化以形成试样成分微粒。但Corona®电喷雾式检测器是通过充氮气将其电离，然后检测它们的电学性质。Corona®电喷雾式检测器的灵敏度对成分性质的依赖性稍低，因此其检测的灵敏度要高于ELSD检测器。Corona®电喷雾式检测器所需的洗脱液与ELSD检测器所需的洗脱液相似，它也是一种质量型检测器，更具有广阔的应用前景；特别是质谱检测器，也是一种非选择性的通用型检测器，具有广阔的应用前景。

对使用者来说，当然希望拿到的一台检测器能够解决很多样品的检测，所以，一般来讲，非选择性HPLC检测器(通用性HPLC检测器)比选择性检测器好。但是还要全方位看问题，从仪器结构、灵敏度、价格、使用成本等多方面来讲，紫外检测器、荧光检测器还是有优势的。

综上所述，蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电喷雾检测器、质谱检测器等都是非选择性的、通用型的检测器；紫外检测器和荧光检测器等是选择性检测器。一般来讲，非选择性的检测器比较好，因为它是通用型的检测器，适用性强，理论上讲可以对任何物质进行检测。但是它的稳定性不理想，受温度影响很大，灵敏度也不如紫外、荧光检测器高。但是近几年发展起来的质谱检测器，灵敏度很高，值得重视。

23．为什么紫外检测器和荧光检测器两者串联使用时不好？

答：很多使用者，为了能够用一台HPLC同时检测某混合物中的有紫外吸收，发天然荧光、有紫外吸收，不发天然荧光、没有紫外吸收也没有天然荧光(但是用衍生法能发荧光)的样品，常常将HPLC的紫外检测器和荧光检测器两者串联使用。这种使用方法是不好的，因为二者串联使用，会使流入到第二个检测的样品形成峰扩散，从而降低灵敏度，使得本来可以检测出来的成分无法检测出来；同时，用两台检测器检测一个混合样品，使用成本太高。如果使用作者研发的一机两用的HPLC紫外/荧光检测器，就可以保证检测灵敏度，保证分析测试结果的可靠性。但是，其成本也不是很低。

24．为什么HPLC紫外检测器的氘灯要求采用直流恒流电源？

答：根据仪器学理论，一般常用的直流电源有3种，即恒流电源、恒压电源、恒功率电源。所谓恒流电源，就是指电源的工作电流恒定不变，而电压则允许变化；恒压电源则是指电源的工作电压恒定不变，电流可以允许变化；恒功率电源则是电源的电压和电流都恒定不变。HPLC紫外检测器的氘灯是一种气体放电光源，主要依靠氘灯灯泡里面的电子云将氘灯的灯丝和氘灯的阴极发射的电子传输到阳极，形成电子流，最后形成电能变热能再变成光能而发光。氘灯在工作时，流过它的电流是恒定的，可以把它看成一个恒流源。科学家研究表明，当氘灯恒流电源的电流波动1%，则其发出的光波动6.7％。一般氘灯电源的电流调整率约在0.05％，工作电流为300mA，此时氘灯电源的电流波动值一般很容易限制在0.15mA左右，这时，对氘灯发光波动性的影响很小；如果氘灯采用直流恒压电源，则可能因为发热等因素，氘灯电流可能会波动。如上所述，电流波动1％时，影响发光的波动性达到6.7％；尽管也能控制恒压电源的电压调整率在0.05%，但是，它对氘灯发出的光影响的波动值达到6.7％。再说，本身为恒流源的氘灯，配置恒压电源也是不妥当的。所以，HPLC的紫外检测器的氘灯要求采用直流恒流电源。

25. HPLC的漂移与哪些因素有关？

答：影响HPLC漂移的因素比较多，最重要的有高压泵的稳定性、色谱柱的性能、检测器的稳定性等。高压泵一般是一种恒流泵，如果它输出的流动相不稳定(由于漏液、压力波动等)，肯定会影响整个HPLC系统的稳定性。色谱柱的质量好坏，特别是色谱柱堵塞、接头漏液、色谱柱本身质量变坏等，都会影响整个HPLC系统的稳定性。检测器是直接反映HPLC系统稳定性的指示器，整个HPLC系统的稳定性，基本上可以通过检测器反映出来。检测器本身的漂移等问题会使HPLC系统的漂移增大。此外，HPLC的各类检测器的电子学系统也会直接影响HPLC系统的稳定性；移动相的稳定性、环境温度等也会影响HPLC系统的稳定性。

26．如何测试HPLC的检测限？

答：从仪器学理论的角度讲，检测限是HPLC系统的一项最重要的性能技术指标，它表征HPLC系统的灵敏度和检测能力，因此制造者、使用者都应该重视对HPLC检测限的测试。一般科技工作者(包括制造者)常用化学样品测试HPLC的检测限，例如采用苯、蔡或蒽溶液直接测试HPLC系统的检测限；一般是配制以数量级递增的一系列溶液(10^-5～10^-7mg/mL的上述溶液，直接在HPLC上测试)；也可以利用信噪比(S/N)的理论，间接测试HPLC的检测限。主要判据就是测出HPLC系统的信号等于噪声2倍或3倍时的吸光度值或浓度值就是检测限。大多数制造者用此方法检测HPLC的检测限，该方法能比较客观反映仪器的灵敏度或检测限。有些外商往往对HPLC的噪声采用计算机平滑，使HPLC的噪声显得很小，但是实际上，噪声平滑了，信号也会被平滑掉一部分，仪器的信噪比还是很小、或者检测限还是很差。同时，经过平滑后，表面上看噪声是小了，但是，硬件中的噪声仍然存在，所以，做样品分析时，仪器的灵敏度或检测限还是不行，不能得到满意的检测结果。

27. HPLC的光学类检测器中最常用的光电倍增管、硅光电池和二极管阵列三种光电转换元件各有哪些优缺点？

答：在HPLC的光学类检测器中，光电倍增管是使用最多的一种光电转换元件，特别在高档HPLC中更是如此；在一般的中低档HPLC中，目前很多厂商采用硅光电池作为光电转换元件；在多维的HPLC中目前大多数采用二极管阵列作为光电转换器件。在三者中，光电倍增管的光谱响应范围最宽(可达到190～900nm)、灵敏度最高，其电流放大倍数可以得到10⁶，同时它的噪声也很小，一般优质光电倍增管的暗电流可以达到10^-10左右；但是光电倍增管的价格贵，特别是高档光电倍增管的价格非常昂贵，并且使用时必须外加非常稳定(电压调整率约为10^-5)的直流高压电源；一般的光电倍增管制造商，在出厂检验时加1000V直流高压电源，此时的电流放大倍数约10⁶倍。作者的实践表明，使用时一般加500～700V直流高压电源，此时的放大倍数约10⁵。目前日本滨松生产的光电倍增管在全球最好，全球很多HPLC制造商都采用他们的光电倍增管。硅光电池是目前全球HPLC制造商使用最多的光电转换元件之一，它的最大优点是成本低，工作时不需要外接电源，其实用的波长范围为200～1100nm；但是它本身没有放大倍数。二极管阵列的优点与硅光电池相同，缺点是也没有放大倍数，价格也较贵，并且在电子学、计算机方面要求较高。

28．为什么要控制HPLC流动相的pH?

答：在HPLC的使用中，流动相的pH对分离效果影响很大，所以要对流动相的pH进行控制，以求得到最佳pH，保证分离效果。为什么要控制pH？因为流动相在HPLC的色谱柱中，会与色谱柱的固定相和样品产生键合作用(发生化学反应)，这个键合作用与流动相的pH有关。有时样品分不开，只要认真调节流动相的pH(一般是调小)，就能很好地把样品的几个峰分开。另外，色谱峰拖尾也往往与流动相的pH有关。所以，控制HPLC流动相的pH非常重要。

29. HPLC的色谱柱填料有何要求？

答：这是一个很复杂的问题，请读者参阅本书第2章的有关部分。

30. HPLC的移动相为什么要脱气？常用的脱气方法有哪几种？

答：HPLC的流动相中一般都含有空气(空气溶解在流动相中)，使用前必须脱气，否则，如果气泡进入色谱柱，会严重损害色谱柱；同时如果柱后压力下降，会使溶解在流动相中的空气自动脱出而形成气泡，这些气泡进入检测器后，会影响检测器的正常工作，会出怪峰。在梯度洗脱时这种情况非常明显。所以，洗脱液的脱气非常重要。一般的脱气方法有四种：①在线自动脱气法；②超声波脱气法；③低压脱气法；④吹入惰性气体脱气法。

相关链接：HPLC仪器实践中具有实际使用价值的100个问题（二）