遗传标记(genetic marker)是指可以稳定遗传的、易于识别的、特殊的遗传多态性形式。在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变(差)异。在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异或者是DNA序列的差异。通过一定的检测手段，识别和研究这种遗传多态性，可以帮助人们更好地研究生物的遗传与变异规律。在遗传学研究中，遗传标记作为染色体上的界标，主要应用于连锁分析、染色体变异、基因定位、遗传作图及基因转移等。在作物育种中，通常把与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用于对目标性状进行追踪选择、辅助选择以及基因型鉴定等。

作物的大多数农艺性状均表现为数量性状的遗传特点。过去，由于缺乏足够的遗传标记，以至长期以来有关数量性状基因的数目、在染色体上的位置及作用效果都不清楚，影响了数量性状的研究进展。近年来，随着分子生物学的迅速发展，分子标记技术已成为分子生物学技术的重要组成部分。以20世纪50年代同工酶的发现为开端，伴随着生命科学领域理论与技术所取得的重大突破，尤其是DNA双螺旋结构的阐明、PCR技术的诞生、全基因组的测序，使分子标记技术从蛋白质向DNA分子水平逐步深化，至今已衍生出几十种用于不同研究目的的分子标记。随着基因组研究的开展，近十年来，在许多重要农作物中都建立了分子标记遗传连锁图，且遗传图上的分子标记数量远远超过过去几十年用形态和生理、生化标记构建的经典遗传图，人们已可能利用分子标记及其连锁图对复杂的数量性状进行分解研究，极大地推进了遗传学和作物遗传育种的发展。在本章中，我们将主要介绍遗传标记的发展、分子标记的分类及特点、分子标记遗传连锁图谱的构建以及分子标记技术在作物遗传改良等方面的应用。

一、遗传标记的发展

遗传标记的发展与分子生物学的发展紧密相连，人类对生命现象的认识从外部形态水平深入到分子水平的同时，遗传标记也从形态标记发展到了DNA分子标记。

19世纪60年代，孟德尔(Mendel)以豌豆为材料，利用7对外部形态特征差异明显、易于识别的相对性状，对杂种后代的不同个体依性状表现进行归类分析，提出了“遗传因子”假说，首创了将形态标记作为遗传标记的先例。

1910年以后，摩尔根将孟德尔“遗传因子”的行为与染色体的行为结合起来进行研究，证实了“遗传因子”是染色体上占有一定位置的实体，由此导致了细胞遗传学的诞生。通过对不同物种染色体形态、数目和结构的研究，发现各种非整倍体、染色体结构变异以及各种异形染色体等都有其特定的细胞学特征，可以作为一种遗传标记来测定基因所在的染色体及其相对位置，或通过染色体代换等遗传操作进行基因定位。这种能明确显示遗传多态性的细胞学特征，通称为细胞学标记。

1941年，美国遗传学家Beadle和生化学家Tatum通过研究红色面包霉的生化突变型，对一系列营养缺陷型进行遗传分析，提出了“一个基因一个酶”的假说，创立了生化遗传学。20世纪50年代，许多科学家发现同一种酶可具有多种不同的形式。同时由于淀粉凝胶电泳技术的发展和组织化学染色剂的使用，使这种酶的多种形式成为肉眼可辨的酶谱带型。1959年，Markert和Moiler根据对几种动物乳糖脱氢酶(ADH)的多种形式的研究，提出了用同工酶(isozyme)一词来描述具有同一底物专一性的不同分子形式的酶，并证实了同工酶具有组织、发育及物种的特异性。通过同工酶的电泳谱带可以清楚地识别同工酶的基因型，因此可以作为一种遗传标记加以利用，并且可以将编码酶的基因通过遗传分析定位在染色体上。同工酶标记是建立在生化遗传学基础上的，所以又称为生化标记或蛋白质标记。

1953年，Watson和Crick提出了DNA分子结构的双螺旋模型，圆满地解释了DNA就是基因的有机化学实体，宣布了分子遗传学时代的到来。1980年，人类遗传学家Botstein等首先提出了RFLP可以作为遗传标记的思想，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。RFLP标记的诞生大大加速了各种生物遗传图谱的建立和发展，同时也提高了基因定位的精度和速度。1985年，DNA聚合酶链反应(PCR)技术的诞生，使直接体外扩增DNA以检测其多态性成为可能。1990年，Williams等和Welsh等两个研究小组应用PCR技术同时发展了一种新的RAPD分子标记。随后，基于PCR技术的新型分子标记不断涌现，使DNA标记走向商业化、实用化。

由形态标记向分子标记逐步发展的过程，体现了人类对基因由现象到本质的认识发展过程。在这一过程中，传统的形态标记和细胞学标记是遗传标记发展的基础，而蛋白质标记和DNA分子标记则是遗传学、生物化学和分子生物学的发展导致遗传标记发展的必然结果。随着科学技术的不断进步，新型的分子标记还将不断涌现，尤其是新一代测序技术的发展带来DNA标记技术的新革命。

二、遗传标记的种类

如上所述，遗传标记包括形态标记(morphological marker)、细胞学标记(cytological marker)、生化标记(biochemical marker)、分子标记(molecular marker) 4种类型。在植物遗传育种研究中可被应用的遗传标记应具备以下条件或特点：①多态性高；②表现共显性，能够鉴别出纯合基因型和杂合基因型；③对主要农艺性状影响小；④经济方便，容易观察记载。下面将几种标记类型的特点作简要介绍。

(一)形态标记

形态标记是指那些能够用肉眼明确观测的一类外观特征性状，如植株高矮、花色、粒型、粒色、穗形、白化、变态叶等。从广义上讲，形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状[如生理特性、生殖特性(育性)、抗病虫性等]。形态标记的优点是简单直观、经济方便、容易观察记载。长期以来，作物种质资源鉴定及育种材料的选择通常都是根据形态标记来进行的，根据形态特征标记某一染色体区段，并对其他未定位的基因(或突变性状)进行连锁分析。

具有特定形态特征的遗传标记材料，一般是通过自然突变或物理、化学诱变方法获得的。形态性状材料多数仅带有一个标记基因，但有的则带有多个标记基因。利用不同标记基因材料间的相互杂交，选择具有多个标记分离的材料，通过二点、三点连锁测验法可确定标记基因与目标性状之间的关系。形态标记材料在遗传研究和作物育种上都有重要的应用价值，因此对形态标记材料的收集、保存和利用历来受到各国研究者的重视。据不完全统计，水稻、番茄中已鉴定出上百个形态学标记。国际水稻所和日本系统地收集多达300多个形态标记的水稻材料，并作为重要的种质资源加以保存。大量形态标记的发现，不仅为遗传研究提供了宝贵材料，而且为作物育种提供了大量显性标记，提高了选择效率。

由于形态标记数量少、可鉴别标记基因有限，因而难以建立饱和的遗传图谱。另外，许多形态标记还受环境、生育期等因素的影响，还有一些形态标记对植株的表型影响太大，并与不良性状连锁，使形态标记在植物遗传育种中的应用受到一些限制。

(二)细胞学标记

细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体数目的变化和染色体结构的变异(如缺失、易位、倒位、重复等)常常引起某些表型性状的异常，染色体结构和数量变异常具有相应的形态学特征，它们分别反映染色体结构上和数量上的遗传多态性。

染色体结构特征包括染色体的核型和带型。核型特征是指染色体的长度、着丝粒位置和随体有无等，由此可以反映染色体的缺失、重复、倒位和易位等遗传变异；带型特征是指染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄和位置顺序等，由此可以反映染色体上常染色质和异染色质的分布差异。染色体数量特征是指细胞中染色体数目的多少，染色体数量上的遗传多态性包括整倍性和非整倍性的变异，前者如多倍体，后者如缺体、单体、三体、端着丝点染色体等非整倍体。

染色体数目和结构的特征可以作为一种遗传标记，将具有染色体变异的材料与正常染色体材料进行杂交，其后代常导致特定染色体上的基因在减数分裂过程中的分离和重组发生偏离，由此可以测定基因所在的染色体及其相对位置。例如，番茄三体，烟草单体，玉米B-A易位系，水稻初级三体，小麦整套单体、端体以及缺体-四体，棉花易位系、单体等材料在基因的染色体定位研究中发挥了重要作用。

细胞学标记虽然可以克服形态标记的某些不足，但是细胞学标记材料需要花费较多的人力和较长的时间来鉴定培育，并且有些细胞学标记常常对生物体本身有害；同时，某些物种对染色体数目和结构变异反应敏感、适应变异的能力较差、材料的保存较困难。更重要的是，一些不涉及染色体数目、结构变异或带型变异的性状，难以用细胞学方法检测。用非整倍体进行定位，可以把基因定位到某一特定的染色体，但难以开展基因的精细定位。另外，到目前为止，可利用的细胞学标记仍屈指可数。

(三)生化标记

生化标记主要包括储藏蛋白、同工酶等标记，也指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。用做遗传标记的蛋白质通常可分为酶蛋白和非酶蛋白两种。在非酶蛋白中，用得最多的是种子储藏蛋白。目前，采用等电聚焦一聚丙烯酰胺凝胶电泳(IEF-PAGE)和SDS-PAGE等方法，对种子储藏蛋白进行电泳分析，可以得到品种的指纹图谱。

在酶蛋白中，利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶及特异性染色来检测的同工酶，是另一类主要的生化标记。具有功能相同但结构及组成有差异的同工酶，通常是指一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式，或指由一个基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式(也称为等位酶)。它们的遗传学行为符合孟德尔规律，共显性表达，具有多型性等特点，因而是一种良好的遗传标记。编码同工酶的基因可通过遗传分析定位在染色体上，且可通过二点、三点测验法对同工酶基因与性状基因间进行连锁分析。

与形态标记、细胞学标记相比，生化标记鉴定可以通过直接采集组织、器官等少量样品进行分析，它首次突破了把整株样品作为研究材料进行分析的方式，而且蛋白质是基因表达的产物，并可以直接反映基因产物的差异，且受环境影响较小。基于这些优点，生化标记在过去的20世纪70～80年代中受到相当的重视与发展。至今，在豆类作物中已经发展了近70种酶检测系统，可以鉴定100个左右的基因座位。在水稻等作物中，已鉴定出具有多态性的同工酶位点近160个。不过，在某个特定的作物群体中，可使用的同工酶标记的数目还相当有限，大多数作物不足30个，表现出多态性的同工酶种类和等位基因的同工酶标记就更少了。同工酶标记还存在其他不足，如每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术；某些酶的活性具有发育和组织特异性；同工酶标记局限于反映基因组编码区的表达信息等。总之，同工酶提供的遗传标记数目和特点远远不能满足植物遗传育种多方面的要求。

(四)DNA分子标记

DNA分子标记是DNA水平上的遗传多态性，这里简称为分子标记。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，甚至，是单个核苷酸的差异。因此，DNA分子标记在数量上几乎是无限的。当然，生物体的DNA序列差异(包括DNA片段差异、单核苷酸位点的差异等)需要通过一定技术方法加以检测。自1974年Grodzicker等利用限制性内切核酸酶和核酸杂交技术原理建立RFLP标记技术以来，分子标记技术的发展十分迅速，数十种名称各异的分子标记技术相继问世。目前，DNA分子标记技术已广泛应用于种质资源研究、系统分析、品种注册、专利保护、遗传图谱构建、基因定位和分子标记辅助选择等方面。

理想的分子标记具有以下特点；①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，而且不受环境限制，不存在是否表达的问题；②多态性高，自然界存在着许多等位变异，不需要专门创造特殊的遗传材料；③共显性遗传、遗传信息完整，由于分子标记通常是通过电泳以凝胶上的条带显现，因而可通过条带在父、母本及F1代中的表现来判别是显性还是共显性(图12-1) ;④数量多，遍及整个基因组，检测位点近乎无限；⑤在基因组中分布均匀；⑥表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；⑦稳定性和重复性好；⑧容易获得且可快速分析；⑨开发成本和使用成本低。尽管目前发展出几十种分子标记，但没有一种分子标记完全具备上述理想特点。在具体实施时，可根据不同研究目的进行选择或将不同类型的分子标记结合使用。

图12-1 分之标记的共显性与显性

分子标记是以DNA为起始研究对象，目前主要的研究技术归纳如图12-2所示。电泳是最常用的分离核酸的技术，DNA分子在凝胶中泳动时是通过电荷效应、浓缩效应和分子筛效应进行分离的。目前主要有两种凝胶介质：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小。普通琼脂糖凝胶分离的DNA为0.2～20kb。用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下可以检出1～10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺单体和甲叉双丙烯酰胺交联剂在催化剂(如过硫酸铵)作用下形成的凝胶。凝胶孔径大小可以通过制备时所使用的浓度和交联度控制。

聚丙烯酰胺凝胶分离小片段DNA (5～500bp)效果较好，其分辨力极高，甚至相差1bp的DNA片段就能分开。聚丙烯酰胺凝胶可通过EB染色或硝酸银染色来显示DNA条带。

图12-2分子标记分析主要研究技术

依据对DNA多态性检测手段的不同，DNA分子标记大致可分为四大类。

第一类是基于DNA DNA杂交的分子标记。该标记技术是利用限制性内切核酸酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后用经过标定的特异DNA探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示DNA的多态性。其中最具代表性的是RFLP标记。

第二类是基于PCR的分子标记，其代表性技术为RAPD, SSR, SSR间区(inter-SSR,ISSR)及碱基插入／缺失(insert/deletion, Indel)等。

第三类是基于PCR和限制性酶切相结合的分子标记。这类分子标记可分为两类，一类是通过对限制性酶切片段的选择性扩增来显示限制性片段长度的多态性，如扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, AFLP)标记；另一类是通过对PCR扩增产物的限制性酶切来揭示多态性，如酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)标记。

第四类是基于单核苷酸多态性的分子标记，如单核苷酸多态性(single nucleotide poly-morphism，SNP)标记。

三、DNA分子标记多态性的分子基础

DNA变异能否成为遗传标记取决于DNA多态性检测技术。目前，DNA分子标记多态性的分子基础主要有：①碱基变异导致的酶切位点或PCR引物结合位点的突变(图12-3A)，如RFLP, AFLP, CAPS, RAPD等；②酶切位点或PCR引物结合位点之间的插入或缺失突变(图12-3B, C)，如RFLP, AFLP, CAPS, RAPD等；③酶切位点或PCR引物结合位点之间串联重复单元的数目变化，如SSR等(图12-3D) ;④单核苷酸突变，如SNP(图12-3E)。

图12-3DNA分子标记多态性的分子基础(左侧为原理示意图，右侧为凝胶检测结果示意图)