一、基于DNA-DNA杂交的分子标记

RFLP最早由Grodzicker等于1974年提出，也是最早发展起来、应用最广的分子标记技术，至今仍被广泛应用。RFLP技术的基本原理是利用特定的限制性内切核酸酶识别并切割(消化)不同生物个体的基因组DNA，得到许多大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过琼脂糖凝胶电泳将这些片段按大小顺序分离开来，然后将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维膜后，用放射性同位素(如³²P)或非放射性物质(如生物素、地高辛等)标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交(即Southern杂交)，若某一位置上的DNA酶切片段与探针序列相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上，后经放射自显影或酶学检测，可显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性情况(形成不同带谱)，即反映个体特异性的RFLP图谱(图12-4)。

图12-4 RFLP技术步骤(Hartl and Jones, 2001)

它所代表的是基因组的DNA在限制性内切核酸酶消化后产生的片段在长度上的差异，由于不同个体等位基因之间碱基的互换、重排、缺失等变化导致限制性内切核酸酶识别位点发生改变，从而造成基因型间限制性片段长度的差异。因此，凡是可以引起酶切位点变异的突变[如点突变(新产生和去除酶切位点)]和一段DNA的重新排列(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化)等均可导致RFLP的产生。图12-5为酶切位点变异造成基因型间限制性片段长度差异的示意图。

图12-5限制性内切核酸酶位点的变异产生的酶切片段长度多态性

RFLP标记具有共显性、重复性和稳定性好等特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1～4个。RFLP探针主要有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆(random genorne克隆，RG克隆)和PCR克隆。RFLP技术也存在一些缺点。例如，用于RFLP分析的探针必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辨的带型，表现为弥散状(smear)，不易进行观察分析。另外，检测所需样本DNA量大(5～15ug)，实验操作较繁琐，检测少数几个探针时成本较高，用做探针的DNA克隆制备较麻烦，检测中如要利用放射性同位素(通常为³²p)，易造成环境污染，检测周期长。虽然也可以用非放射性物质(如Biotin系统、Dig系统及ECL系统)替代同位素，但其杂交信号相对较弱，灵敏度较同位素标记低且相对价格较高。

二、基于PCR技术的分子标记

PCR技术是以短核苷酸序列作为引物，并使用一种耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)扩增目标DNA序列。Muller于1985年发明了该技术，并因此获得了1993年度诺贝尔化学奖。由于PCR技术具有快捷、简易、灵敏等优点，已被广泛地应用于分子克隆、基因诊断、系统分类学、遗传学和育种学等方面，对DNA标记技术的发展起到了巨大的推动作用。

根据引物的随机性或特异性，以及引物碱基的大小，可将PCR标记分为随机引物的PCR标记和特异引物的PCR标记。按照PCR所需引物类型又可分为：①单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括RAPD标记、ISSR标记等技术；②双引物选择性扩增的PCR标记，主要通过引物3'端碱基的变化获得多态性，如序列相关扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)标记；③需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记，如SSR标记；④序列特征化扩增区域(sequence characterized amplified region, SCAR)技术和序标位(sequenced- tagged site, STS)等。

利用PCR技术极大地降低了对样品数量和质量的要求，通常几十纳克(ng)以内的DNA样品就足以应付一般分析的需要。这为分子标记辅助育种、数量性状基因定位等研究带来了很大的便利。此外，PCR还可以锁定特定的目标DNA区域进行扩增，有利于后续序列测定、功能研究等工作的开展。

(一)RAPD标记

RAPD技术是在1990年由Williams和Welsh提出的。该技术是用任意寡聚脱氧核苷酸单链的片段(通常长度为8～10bp)作引物，也称为随机引物(arbitrary primer)，通过PCR扩增基因组DNA获得长度不同的DNA片段，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，经EB染色来显示扩增片段的多态性(图12-6)。扩增片段多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。

RAPD所有引物只有常规PCR引物长度的一半，因此在PCR中必须使用较低的退火温度(一般为36℃左右)，才能使引物与模板DNA结合；此外，较短的引物和较低的退火温度增加了引物与模板的错配，从而提高了揭示多态性的能力。RAPD所使用的引物量各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组。因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。

图12-6 RAPID扩增图谱(引自Tanya et al., 2011)

RAPD具有以下优点：①技术简单、分析量大、操作自动化程度高，且免去了RFLP中制备探针、同位素标记、Southern印迹及分子杂交等步骤，分析速度很快；②所需DNA样品量少(一般5～10ng)，对DNA质量要求较RFLP低；③不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析，同时，RAPD标记还可转化为SCAR及STS等表现为共显性的分子标记；④成本较低。但RAPD也存在一些缺点：① RAPD标记通常表现为显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；②存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度的DNA片段，而不能分开那些长度相同但碱基序列组成不同的DNA片段；③ RAPD技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。

(二)SCAR标记

SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记。1993年，Pa-ran等提出了一种将RAPD标记转化成SCAR的新方法，其基本步骤是：在对基因组DNA作RAPD分析后，将目标RAPD片段(如与某目的基因连锁的RAPD片段)进行克隆并对其末端测序，根据RAPD片段两端序列设计特定引物，通常为18～24bp，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。以此引物对基因组DNA片段再进行PCR特异扩增，这样就可以把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。

由于分辨力等原因，回收后的DNA片段很可能混有一些杂带。因此，目标特征带被回收后，需用原来的任意10bp引物重新进行扩增，用相应的亲本作阳性、阴性标记，以确定目标特征带的位置。将扩增产物电泳，若凝胶上显示扩增产物仅为一条带，则回收该带并直接克隆到目标载体上；若扩增产物为多条带，则依据阴性、阳性对照确定目标特征带的位置，然后将其回收用于克隆。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选含目的片段的单克隆，测序分析、设计引物，分析PCR扩增检测是否还能扩增出原来的多态性。这样转化成功的标记就称为SCAR标记。

SCAR标记一般表现为扩增片段的有无，为一种显性标记；但有时也表现长度的多态性，为共显性标记。相对于RAPD标记，SCAR标记所用引物长，因此它具有更高的重复性和稳定性。因此，SCAR比RAPD和其他利用随机引物的标记方法在基因定位和遗传作图中有更好的应用前景。

(三)SSR标记

SSR即简单序列重复，又称为微卫星DNA，它是一类由1～6个碱基组成的基序(mo-tif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于基因组的不同位置。例如，(CA)n,(AT)n、(GC)n, (GATA)n。等重复，其中n代表重复次数，其大小为10～60。这类序列的重复长度具有高度变异性。其中最常见是双核苷酸重复，如(CA)n。和(TG)n,其多态性主要来源于串联数目的不同。SSR的产生是在DNA复制或修复过程中DNA滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换的结果。

通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明，微卫星在植物基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于整个植物基因组中。但不同植物中微卫星出现的频率变化非常大。例如，在主要的农作物中两种最普遍的二核苷酸重复单位(AC)n，和(GA)n。在水稻、小麦、玉米、烟草中的数量分布频率是不同的。在小麦中估计有3000个(AC)n。序列重复和约6000个(GA)n、序列重复，两个重复之间的距离平均分别为704kb, 440kb；而在水稻中，(AC)n。序列重复约1000个，(GA)n。重复约有2000个，重复之间的平均距离分别为450kb,225kb。另外，在植物中也发现一些三核昔酸和四核苷酸的重复，其中最常见的是(AAG) n和(AAT)n。在单子叶和双子叶植物中，SSR的数量和分布也有差异，平均分别为64. 6kb和21. 2kb中有一个SSR。研究还发现，单核苷酸及二核苷酸重复类型的SSR主要位于非编码区，但有部分三核苷酸类型位于编码区。水稻基因组测序结果表明，水稻全基因组中两碱基、三碱基为重复单元的SSR分别占24％和59％，平均8kb就含一个SSR，显示出SSR作为遗传标记的巨大潜力。另外，在叶绿体基因组中，目前也报道了一些以A/T序列重复为主的微卫星。

SSR标记的基本原理见图 12-7。由于基因组中某一特定微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼两端互补序列人工设计合成引物，通过PCR反应扩增微卫星片段。由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，不同个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性又称为简单序列重复长度多态性(SSLP)(图12-8)。

图12-7 SSR多态性示意图

图12-8BNL3655 (A)和BNL2921 (B)对‘DH962' X‘冀棉5号’部分F2代群体的扩增图

由上可见，SSR标记的关键是特异PCR引物的获得。目前，发展了很多SSR标记开发的方法，传统的SSR标记开发的一般程序是：①建立基因组DNA文库；②根据得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆，如想获得模体为(GT)n/(AC)n。的SSR，则可合成(CA)n/(TG)n。作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆；③对阳性克隆DNA插入序列测序；④根据SSR两侧序列设计并合成引物；⑤以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应；⑥高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。与此同时，人们也在不断探索能够简化技术环节、提高效率、降低成本的开发方法，并相继出现多种采取富积步骤的微卫星标记开发方法，如基于RAPD的开发策略、引物延伸法、选择杂交法等。用以上方法开发出来的SSR称为genomic SSR (gSSR)，种属特异性较强。

除此之外，随着测序技术的发展，对许多作物都开展了全基因组测序工作，随着各种作物EST的迅速发展，公共数据库中的现成序列越来越多，为SSR标记的开发提供了一种新途径。利用已有的序列，借助于一些SSR搜索软件，如Sputnik, MISA, SSRLocator等可迅速筛选出含SSR的序列，并可根据侧翼序列设计引物。这种方法省略了文库构建、克隆筛选及测序的步骤和成本，使SSR标记的获得更加容易。从EST中开发的SSR称为EST-SSR，由于其来源于比较保守的表达序列，与gSSR相比，EST-SSR在不同种属间的通用性较高，可用于比较基因组学研究。但EST-SSR的多态性比gSSR低。

SSR与其他分子标记相比具有以下一些优点：①一般检测到的是单一的复等位基因位点，提供的信息量高；②微卫星以孟德尔方式遗传，呈共显性，可鉴别杂合子和纯合子；③所需DNA量少；④数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高。

(四)ISSR标记

早期的SSR标记耗时费财，但其优点突出，尤其是在基因组中分布广泛、变异大。1994年Zietkiewicz等在SSR标记的基础上发展了ISSR标记。其基本程序是，以锚定的微卫星DNA序列为引物，PCR扩增基因组DNA，然后通过电泳检测其扩增产物的多态性。ISSR引物的特点是直接以不同重复次数的基序(motif)作引物，或在其两端加上儿个非重复的锚定碱基组成随机引物对基因组DNA进行选择性扩增，如(AC)nX, (TG)nX,(ATG)nX,(CTC)nX, (GAA)nX等(X代表非重复的锚定碱基)；引物的长度一般要达到15bp或以上。SSR标记揭示的是SSR自身的长度差异，而ISSR标记的多态性来自于相邻SSR之间序列长度的差异(图12-9)。

图12-9ISSR标记示意图

与SSR不同的是，ISSR不需要通过获得SSR的侧翼序列来开发引物，因而开发费用低；另外，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记那样具有较强的物种特异性。与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可以与RFLP相媲美，检测非常方便。此外，当用不同基序作引物扩增同一基因组时，可根据扩增产物的多少间接衡量与引物基序互补的基序在基因组中的分布情况(图12-10)。目前该标记已用于遗传作图、品种鉴定、遗传分化等研究。

图12-10ISSR标记扩增图谱(Blair et al.，1999)

(五)STS标记

STS标记是对以特异引物序列进行PCR扩增的，一类分子标记的统称。通过设计特异性引物，使其与基因组DNA序列中特定位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。1989年，华盛顿大学的Olson等以STS单拷贝序列作为染色体特异的界标(landmark)，即利用不同STS的排列顺序和它们之间的间隔距离构成STS图谱，作为该物种的染色体框架图(framework map), STS在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点。

目前，STS引物的设计主要依据单拷贝的RFLP探针，根据已知RFLP探针两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增，然后通过电泳揭示多态性。这也可以称为RFLP-PCR与RFLP相比，STS标记最大的优势在于不需要保存探针克隆等活体物质，只需从有关数据库中调出其相关信息即可。STS标记的突出优点表现在：①共显性遗传；②很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的比较，是沟通遗传图谱和物理图谱的中介；③特异序列的STS用来确定物理图谱及DNA片段排序在染色体上的位置。与SSR标记一样，STS标记的开发依赖于序列分析及引物合成，目前成本仍显太高，但一旦开发出来，同行受益无穷。目前，国际上已开始收集STS信息，并建立起相应的信息库。

(六)SRAP标记

SRAP标记是由Li与Quiros于2001年提出的。该标记通过独特的引物设计对开放阅读框(open reading frame, ORF)进行扩增。上游引物长17bp, 5’端的前10bp是一段填充序列，紧接着是CCGG，组成核心序列及3'端3个选择碱基，对外显子进行特异扩增。下游引物长18bp, 5'端的前11bp是一段填充序列，紧接着是AATT，组成核心序列及3'端3个选择碱基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增(图12-11)。因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。该标记具有简便、稳定、中等产率、可产生共显性标记、便于克隆测序目标片段的特点。SRAP标记是通过PCR扩增、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳而揭示的多态性(图12-12)。

图12-11部分SRAP引物

图12-12SRAP标记对‘邯郸208'בPima90’及部分F₂代群体中的扩增图(林忠旭等，2003)

由SRAP衍生的标记有靶位区域扩增标记多态性(target region amplified polymor-phism, TRAP)，由Hu和Vick于2003年发展了该标记。TRAP标记以SRAP的上游或下游引物作为随机引物，固定引物以公用数据库中的靶EST序列或特点基因设计而来。PCR扩增条件、电泳及染色程序与SRAP相似。

(七)COS标记

保守同源区段(conserved ortholog set, COS)标记是根据不同物种之间的保守序列而开发出来的一种分子标记。Fulton等(2002)将番茄的EST与拟南芥的基因组序列进行比较，只有当番茄EST与拟南芥形成唯一对应关系且期望值小于e- 15时，这个EST才被认为是保守序列。然后根据序列的保守区段设计引物，共得到1025个COS标记。随后，通过比较番茄、马铃薯、辣椒和咖啡的EST与拟南芥的基因组序列得到单拷贝序列，开发出第二批COS标记。与此同时，美国加利福尼亚州大学戴维斯分校的Richard Michelmorc博士领导的研究小组比较了番茄、生菜、向日葵和玉米的DNA序列，获得2185个COS标记，其中1860个来源于番茄。另外，在松科中通过序列比较也开发了COS标记。COS标记来源于进化保守的单拷贝基因，可用于不同物种的比较基因组学研究、系统进化树研究，并有助于阐明植物进化过程中保守基因的功能变化。

(八) ILP标记

内含子长度多态性(intron length polymorphism, ILP)标记是通过在内含子两侧的外显子上设计一对引物，将内含子扩增出来并进行电泳，来揭示内含子长度的差异。众所周知，不同种属的外显子在进化过程中保守性较强，而内含子受到的选择压力较小、变异较大，存在较多多态性。随着基因组测序的发展，模式植物(如拟南芥、水稻)相继公布了基因组序列，其他植物的基因组序列也陆续被公布。基因组结构信息为ILP标记的开发提供了便利。其他没有基因组序列的植物可通过将EST序列与模式植物进行比较，寻找可能的内含子，再根据EST序列设计引物进行扩增。浙江大学吴为人课题组通过将多种植物的EST与拟南芥和水稻CDS进行比对，开发了大量潜在内含子多态性(potential intron poly-morphism, PIP)标记，可供研究者查询和下载使用。