1．植物总DNA提取

植物总DNA的提取方法很多，但从原理上看主要有两种：CTAB法及SDS法。

(1) CTAB法：十六烷基三乙基溴化铵(cetyl-triethyl ammonium bromide, CTAB)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCI)是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时，CTAB与核酸的复合物在溶液中沉淀，通过离心就可将其同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀(CTAB能溶解于乙醇)。

(2) SDS法：其原理是利用高浓度的SDS，在较高温度65℃条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀(最常用的是加入5mol/L的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物)，离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚／氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀DNA。

DNA提取的具体方法参见相关技术操作手册。

2．植物DNA样品纯度及浓度的检测

Southern杂交的植物DNA样品在纯度、长度及浓度上均应达到一定的要求。纯度上应无蛋白质、RNA,多糖及抑制限制性酶切的杂质，并无提取时所用的试剂，如酚及盐离子的残留。在长度上不应低于50kb，浓度应为0.3～1ug/uL，所以提取的DNA在用于酶切前必须检测其纯度及浓度。目前主要采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法进行检测。

(1)琼脂糖凝胶电泳检测：制备0.8％琼脂糖凝胶，取适量的被检DNA样品及分子质量标准DNA同时电泳，电泳后于紫外光下检测，所提植物DNA应呈现出一条分子质量较大的清晰条带，其迁移率应小于分子质量标准样品λDNA/Hind Ⅱ中23kb条带的迁移率。如果所提DNA样品条带呈现长带弥散状，则表明提取过程中DNA已严重降解。如果在溴酚蓝处出现明亮的荧光区，则表明样品中含有较多的RNA，可用RN_ase消化去除。如果在梳孔内有荧光出现，则可能是因为样品中DNA未完全溶解或浓度过高，或样品不纯导致大量带正电荷的杂质与DNA样品结合。

至于样品浓度，对于清晰的条带，可通过与标准DNA样品的荧光亮度相比较来估计。例如，使用单一分子质量标准DNA的浓度为0.5ug/uL，点样量为2uL，则DNA量为1ug。亮度与其相同的条带，DNA量大致相同。

(2)紫外分光光度法测定：纯净的DNA溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其260nm及280nm的吸收值比值应为1.8, 260nm及230nm的吸收值比值应大于2.0。若OD₂₆₀ /OD₂₈₀大于1.8，表明样品中含有较多的RNA，这时应该用RN_ase重新处理样品，若比值小于1.6，则说明样品中蛋白质杂质较多或混杂有提取时所用的酚试剂。这时需要用氯仿重新抽提样品进一步去除蛋白质杂质及酚。当OD₂₆₀/OD₂₃₀小于2.0时，表明溶液中有残存的小分子及盐类杂质。可用70％乙醇反复洗涤DNA沉淀。DNA样品纯化后，应根据其在260nm的吸收值，确定样品的DNA浓度。50ug/mL的双链DNA对260nm紫外光的吸收值为1.0。凡是浓度大于0.25ug/mL的纯净DNA样品均基本符合此关系，测定OD₂₆₀值即可确定DNA样品浓度。

3．植物DNA样品的保存

根据所测的样品DNA浓度，用无菌1×TE将样品稀释或浓缩成0. 5～1. 0mg/mL的浓度。高分子质量的DNA溶液在4℃条件下可储存数周，近期使用时不必进行低温冷冻，需要长期储存时，可置-20℃冷冻，但冷冻样品从冰箱中取出时必须立即置于碎冰上，令其缓慢解冻，以防止DNA分子断裂。为防止溶液融化时引起的DNA断裂，也可以将DNA样品以乙醇沉淀的形式保存在-20℃。

4．杂交探针的制备

探针是指经特殊化合物标记的特定的核苷酸序列。用于Southern杂交的探针有DNA探针和RNA探针。根据探针有否放射性又可将探针分为放射性探针及非放射性探针，根据标记物参入部位的情况探针又分为均匀标记探针及末端标记探针。

用于检测植物基因组中外源基因整合的探针应为同源探针，一般认为探针长度在300个核苷酸以上时杂交效果较好，染色体上基因定位的探针应较长，可达2000bp，用于组织细胞内原位杂交的探针应具有较好的组织穿透性及较高的特异性，这时探针长度可短至几十个核苷酸。杂交探针制备包括探针核苷酸序列的获取及探针标记两大部分内容，下面分别进行介绍。

1)探针核苷酸序列的获取

鉴定转基因植株应使用外源基因做探针。探针核苷酸序列一般从工程菌质粒或中间质粒上切取，短的几十个核苷酸的序列可用人工合成寡核苷酸探针的方法合成，甚至可用PCR扩增产物。

2)探针标记

(1)标记物。

理想的标记物应满足以下几个条件：①标记前后探针的基本结构相同，标记物不影响探针的主要理化性质、杂交特异性、Tm值及酶反应特征等；②检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好并且操作简便、省时；③稳定、安全、无环境污染；④经济。目前用于分子杂交的探针标记物已有20多种，可分为放射性及非放射性两大类，这些标记物都有各自的局限性，寻找理想的探针标记物仍是人们研究的重要课题。

A．放射性标记物。由于原子的化学性质主要取决于核外电子，所以放射性同位素标记的化合物在化学性质上与其相应的化合物相同，同位素标记对酶促反应、碱基配对、分子杂交均无影响。

放射性同位素发出的射线主要有α、β、γ3种。用于核酸探针标记的同位素大多都是发射β射线，但它们发射的β射线在最大能量、半衰期等方面不同，射线能量越大，穿透力强，放射自显影所需时间越短，但分辨力越低。

制备核酸探针时直接使用的放射性标记物大多是三磷酸核苷酸(NTP)或脱氧三磷酸核苷酸(dNTP)。常用的放射性标记化合物有以下几种。①³²p标记的三磷酸核苷酸：³²p标记的三磷酸核苷酸有³²P-NTP及³²P-dNTP两种，前者用于RNA探针标记，后者用于DNA探针标记。³²p发射的β射线能量最大，其标记的核苷酸的放射性最高，因而放射自显影灵敏度高，压片时间最短，可广泛用于各种杂交，尤其适用于植物基因组中单拷贝基因的印迹杂交检测。②³⁵S标记的三磷酸核苷酸：标记的原理是将核苷酸分子中磷酸部分的一个氧原子用³⁵S原子取代，即转变成³⁵S标记的核苷酸。由于35S的β射线较³²p弱，因而其标记的探针检测灵敏度低，但分辨力高，其优点是放射自显影的本底低，邻带间的交叉小，能在底片上形成较密集的曝光带，适于核酸序列测定及细胞原位杂交。³⁵S的半衰期较长(87.1 d)，辐射危害较小，所以³⁵S标记的探针使用起来较为方便和安全，它存在的主要问题是灵敏度较低，放射自显影时粒子穿透力弱。③³H标记的三磷酸核苷酸：³H释放的β射线能量很低，因而分辨力高，放射自显影的本底低，但需较长的曝光时间。其最大优点是半衰期长，标记探针可较长时间保存，主要用于制备高分辨力的原位杂交探针。④¹²⁵I标记的三磷酸核苷酸：其优点是标记物可以化学合成，探针分辨力高，较适用于原位杂交。但其标记的核苷酸较难获得，并在反应中有挥发碘产生，被人体吸收后，能在甲状腺中积蓄，造成较长时间的危害。这几种放射性标记物在Southern杂交中最常用的是第一种。

B．非放射性标记物。为了避免放射性同位素对人体的危害及对环境的污染，近年来逐渐使用非放射性标记物来制备杂交探针。目前使用的非放射性标记物已有十多种，与放射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性较差，但具有稳定性好、分辨力高、检测所需时间短的优点，尤其是不需要放射性防护设备，在安全上大大优于放射性标记探针。

a．生物素：生物素(biotin)是一种水溶性B族维生素，又称为维生素H。其分子中的戊酸羧基经化学修饰可含有各种活性基团，它能与蛋白质、糖、核苷酸、核酸等多种物质发生偶联，从而标记这些物质。生物素标记的探针可通过生物素-抗生物素蛋白的亲和系统检出，也可以通过生物素-抗生物素抗体的免疫系统检出。

生物素是目前非放射性标记物中应用最多的一种。使用生物素标记核酸探针时，需注意探针纯化时不能用酚抽提，因为结合在探针上的生物素能使DNA进入酚相。

b．地高辛：地高辛(digoxigenin)是一种存在于洋地黄类植物的花和叶子中的类固醇类的半抗原，又称为异羟基洋地黄毒苷配基。其通过一个11个碳原子的连接臂与尿嘧啶核苷酸嘧啶环上的第5个碳原子相连，形成地高辛标记的尿嘧啶核苷酸。地高辛标记的Dig-UTP及Dig-dUTP主要通过酶反应标记RNA及DNA探针。

地高辛标记的探针杂交体的检出是利用抗地高辛抗体与地高辛发生免疫结合，抗地高辛抗体上带有的酶标记可通过酶反应检出。

(2)标记方法。

放射性标记有体内标记法和体外标记法，体内标记依靠活体体内代谢完成，如在培养基中添加³H-胸苷可以使生长在该培养基中的活细胞的DNA被标记。体内标记法受细胞中许多因素的影响，一般标记活性不高。体外标记法不需要活体生物，所得探针放射性比活高。体外标记有化学法和酶法两种。化学法是通过标记物的活性基团与核酸分子中的某种基团发生化学反应而进行标记，标记物直接与核酸分子相连。酶法是先将标记物标记在核苷酸上，然后再通过酶促反应使带标记的核苷酸掺入到核酸序列中，产生核酸探针，常用的酶法有切口平移法(nick translation)和随机引物法(random priming)，这两种方法均为均一标记。此外还有多核苷酸激酶的末端标记法，为不均一标记。

非放射性标记物的体外标记同样有化学法和酶法，不同标记物使用的化学标记方法不同，常用的还是酶法，先将生物素、地高辛、荧光素等标记物标记核苷酸，这些非放射标记物标记的核苷酸与放射性同位素32p等标记的核苷酸一样，可按切口平移法、随机引物法以及末端标记法制备成DNA, RNA及寡核苷酸探针，但不能用多核苷酸激酶进行末端标记。

5. Southern杂交

Southern杂交由Southern于1975年建立，用来检测经限制性内切核酸酶切割的植物DNA片段中是否存在与探针同源的序列，并可分析外源基因在植物染色体上的整合情况，如拷贝数、插入方式以及外源基因在转化植株T1代中的稳定性等问题。

1) Southern杂交原理

抽提待检植株的基因组DNA，选择适当的限制性内切核酸酶酶切核酸并用琼脂糖凝胶电泳分离。碱处理使各酶切片段在凝胶上原位变性。利用印迹技术将变性的各酶切片段原位转移到固相膜上。经烘干或紫外线照射处理，使印迹的各片段与固相膜牢固结合。预杂交处理，掩盖膜上的非特异性杂交位点。之后，加入含有单链或经变性处理成为单链探针的杂交液，在适宜的温度条件下进行杂交。膜上存在的与探针同源的单链序列，可通过碱基互补作用与探针杂交成双链，从而使探针固定在相应位置上，形成带标记的特异性杂交体。在杂交过程中或许也会发生一些非特异性的杂交及探针与膜上DNA序列非特异性的结合，这些非特异性的结合及未结合的游离探针可以通过杂交后的漂洗过程而逐步除去。最后根据探针的标记性质进行检出。

2) Southern杂交的实验样品

Southern杂交鉴定外源基因整合必须有阳性及阴性对照，实验前要准备好阳性对照、阴性对照、分子质量标准DNA样品及待检转化植株总DNA样品。

(1)阳性对照样品：含外源基因的中间载体质粒DNA、农杆菌共整合载体的Ti质粒DNA或农杆菌双元载体小质粒DNA 。

(2)阴性对照样品：非转化植株总DNA。

(3)分子质量标准DNA样品：λDNA/HindⅡ、或λDNA/HindⅢ +EcoRⅠ。

(4)被检样品：各转化植株总DNA。

3) Southern杂交的实验程序

Southern杂交需要依次完成如下8个实验步骤：①植物总DNA的限制性酶切；②凝胶电泳分离各酶切片段；③酶切片段原位变性；④转膜；⑤预杂交；⑥杂交；⑦洗膜；⑧杂交体检出。

各程序中的有关问题简述如下。

(1)植物总DNA的限制性酶切。

第一步选择合适的限制性内切核酸酶。多数情况是对植物基因组DNA进行单酶切，也可进行双酶切。酶的选用原则是消化后生成的DNA片段可提供与探针杂交所需的足够信息，即限制片段中必须含有整个探针序列。要满足这一条件，使用的限制性内切核酸酶在探针序列内部(即目的基因内部)不应有切点，这样可以保证从杂交带中分析出外源基因的整合位点数。但有时为了进一步分析外源基因整合拷贝的详细情况，同一种被检植物基因组DNA样品可以用两种不同的限制性内切核酸酶切割，一种在目的基因内无切点，而另一种在目的基因中有单一切点。通过杂交后阳性带的数量比较，若为单位点单拷贝整合，则前者为一条杂交带，后者为两条杂交带；但若为单位点多拷贝整合，则前者为一条杂交带，后者为三条或三条以上杂交带。

第二步设定酶切反应体系。植物DNA的用量一般为5～15ug,酶切体积为20～50uL。由于提取的植物DNA纯度往往不十分高，在多数情况下或多或少含有一些抑制限制性内切核酸酶活力的杂质，故酶的用量要比消化质粒DNA时高一些，一般可增至5～10U/ug DNA。限制性内切核酸酶保存在50％的甘油中，如果酶切反应体系中甘油浓度超过5％，则会引起限制性内切核酸酶专一性改变，所以酶的体积不得超过总反应体积的10％。

第三步检测酶切效果。取部分酶切样品用0.7％或0.8％的琼脂糖凝胶分离，电泳后在紫外灯下观察。酶切效果好的样品应呈现出一条连续的、荧光由深至浅的均匀条带(高分子质量区深，低分子质量区浅)。若样品DNA中含有可被限制酶切下的高度重复序列时，则电泳谱上有可能在连续荧光背景的某一位置上出现集中的条带。如果荧光区仍集中在点样孔附近，则表明样品末被充分酶解。如果在荧光区带两边缘出现荧光较深的轨道，一般是点样量过大(15～20 ug或大于20ug)造成的。前沿呈锯齿状，往往是样品不纯，含盐量较高。条带不均匀，时深时浅，可能是酶解不完全。如果荧光区带中间出现较深的弯月面，则是因电泳时电压过高造成的。出现上述情况时应改变酶切条件、电泳条件或重新纯化DNA。

(2)凝胶电泳分离各酶切片段。首先是制备凝胶。供印迹用的凝胶应有一定的强度，否则在操作中很容易破碎。凝胶浓度取允许范围的上限。凝胶厚度在0. 5 cm以上。为提高分辨力，样品槽应用窄梳子制备，使样品呈细线状。胶板的长度可适当增加一些，以保证样品足够的泳动距离。其次是确定样品及样品量。分子质量标准DNA样品、阳性对照、阴性对照与被检植物DNA样品要点在同一块胶上。阳性对照样品的上样量一定要小，阴性对照样品与被检样品上样量应较大，并要保持一致。分子质量标准DNA样品一般点在最外侧。酶切片段分离时要采用低电压、长时间的电泳条件，一般为1V/cm电泳16h。

(3)凝胶中的DNA变性。Southern杂交必须是单链探针与单链同源DNA片段结合，因此，凝胶上的双链DNA片段必须经变性成为单链。将凝胶浸泡在0. 5mol/L NaOH,1. 5mol/L NaCl溶液中，室温下置于脱色摇床上轻摇，其间更换一次变性液以使DNA充分变性。用硝酸纤维素膜印迹时，碱变性后需要中和。使用尼龙膜时，因尼龙膜对碱稳定，碱变性后不用中和，还可以不经碱变性处理直接用碱溶液进行转移。

(4)印迹。将凝胶上变性的DNA片段原位转移到固相支持物上的过程称为印迹。为满足印迹及杂交操作的要求，固相膜必须具有如下特点：能很好地与DNA分子结合，要求每平方厘米能结合10ug以上的DNA，同时又不影响DNA片段与探针杂交；对探针及其他物质的非特异性吸附小；具良好的机械性能。

A．固相膜的种类及选择。当前在分子杂交检测中常使用的固相膜有两种：硝酸纤维素膜和尼龙膜。

硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane)：该膜的特点是只能与单链DNA或RNA在高盐条件下结合。膜与DNA片段以疏水性结合，烘干后结合能力很强，可达到80～100ug/cm²，但在杂交，尤其是在杂交后的洗涤过程中结合力下降，结合的DNA较易从膜上脱离，所以硝酸纤维素膜一般不能重复使用。该膜与核酸结合依赖于高盐条件，转移时必须使用高盐溶液，故不适于电转移法。该膜对小于200bp的DNA片段结合较差，并且质地较脆，烘烤后易发生碎裂，使用时要注意。它的优点是对探针及蛋白质的吸附作用较弱，因而杂交信号本底低。

尼龙膜：尼龙膜能与单链及双链的多核苷酸链结合。结合能力可高达500ug/cm²时。经烘烤或紫外线照射后，核酸分子中的嘧啶碱基与膜上的氨基相互交联，结合得十分牢固。尼龙膜在低离子浓度条件下对小分子DNA片段(短至10bp)也具有较强的结合力，可用于电转移。该膜较硝酸纤维素膜更实用之处是可重复使用。此外，碱可促进DNA片段与尼龙膜的结合，可以用NaOH溶液进行转移，在转移的同时进行了DNA的变性，转移后也就达到了固定的作用，因而使用尼龙膜可使DNA变性、印迹及固定一步完成，操作程序大大简化。尼龙膜的最大缺点是杂交信号本底高。克服的方法是加大预杂交液中封闭剂的用量，以充分掩盖膜上的非特异性位点。

B．印迹方法及选择。

毛细管转移法：该方法是利用吸水纸的毛细管作用进行转移。将电泳后的凝胶倒放在两张两端浸入转移液中的滤纸上。凝胶上面铺放一张与凝胶大小相同的硝酸纤维素膜或尼龙膜，二者之间不能有气泡。膜上面放2层或3层比固相膜略大的用转移液湿润的滤纸，滤纸上面放一叠干燥吸水纸，吸水纸的大小与滤纸相同。吸水纸上面平放一个塑料板且在其上加0. 5kg左右的重物。在转移过程中，由于吸水纸的毛细管作用，缓冲液沿滤纸上升，形成经过凝胶、膜至吸水纸的液流，这样，凝胶中的DNA片段就被转移到膜上(图11-3)。

图11-3Southern印迹示意图

电转移法：电转移法是利用电泳的原理，凝胶上的DNA片段在电场作用下脱离凝胶，原位转至固相支持物上。电转移法应使用经正电荷修饰的尼龙膜或化学活化膜(ABM或ATP纤维素膜)，不能使用在高盐溶液中与DNA结合的硝酸纤维素膜。电转移前，凝胶用碱处理使DNA变性，然后浸泡在电泳缓冲液中进行中和。中和后的凝胶与尼龙膜贴紧，凝胶和膜外侧各贴1张或2张滤纸，在其外是吸饱缓冲液的海绵。将此体系夹在多孔的支持夹中，固定在电泳槽内，浸泡在电泳缓冲液中。DNA转移的方向是由负极向正极，所以尼龙膜应放在正极侧，凝胶放在负极侧。300～600mA恒流电泳4～8h。

真空转移法：真空转移原理是利用真空作用造成流经凝胶的液流，使凝胶中的DNA片段洗脱出来而沉积在凝胶下面的膜上。该方法的优点是快速，30min能使DNA片段从0. 4～0. 5cm厚的凝胶中转移出来。DNA的碱变性可预先进行，也可在转移的同时进行变性及中和。

三种印迹方法中毛细管转移法不需要特殊设备，虽然转移时间较长，但很有效，可为实验室采用。电转移法及真空转移法需特殊设备。

(5)杂交。

A．杂交反应体系。

探针浓度：杂交反应速率主要由反应物的浓度(探针浓度与膜上同源的DNA的含量)及反应温度决定。探针浓度越高，反应速率越快。但探针浓度过高易使杂交背景增高口要想降低杂交本底，探针的浓度要控制在0.5ng/mL或更低。
杂交反应温度：温度对杂交反应的影响也十分明显。在较低温度范围内，杂交反应速率随反应温度的升高而升高，当温度升至低于杂交链T_m值20～25℃时反应速率最大。若温度再升高，则杂交链解链而影响其稳定性。杂交双链的稳定性由其T_m值决定，T_m值又与其G+C含量、探针长度、离子强度、碱基配对情况及杂交体系中是否含有变性剂甲酰胺等有关，大致的数值可由下面的经验公式得出：

T_m＝81.5℃＋16. 6log(Na⁺)+0. 41 (G+ C)％-600/n-0.63(甲酰胺％)

式中，n为探针的碱基数。

这样的计算其实并无太大的必要。一般来说，不含甲酰胺时，杂交温度采用65℃；有甲酰胺时，杂交温度采用42℃，对于多数杂交反应都是适宜的。

杂交时间：杂交的时间主要由探针的长度及浓度而定。由于杂交过程是一个复性过程，一般杂交时间以Cot_1/2的3倍计算。

放射性探针比活：杂交反应的灵敏度主要取决于目的序列在膜上总DNA中的含量及探针的放射性活性。使用低浓度探针时则要求探针具有高比活。从植物基因组中检测单拷贝外源基因序列时，探针的比活至少为10⁹ cpm/ug DNA。若探针浓度为0.5ug/mL，则杂交液放射性强度为5×10⁸ cpm/mL, 10mL杂交液的放射性为5×10⁹ cpm。

B.预杂交、杂交及洗膜。

预杂交：预杂交的目的是在加入探针前用封闭剂封闭膜上的非特异性位点。固相膜对单链DNA有很强的结合力，不仅能与印迹过去的样品DNA结合，而且也能与探针结合。在印迹后的膜上，除样品占据的位置外还有空余，如不将这些空余部位封闭，探针就会被结合，掩盖了特异性杂交。常用的封闭剂有两类，一类是变性的非特异性DNA，如鲑鱼精子DNA、小牛胸腺DNA等；另一类是高分子化合物，如Ficoll 400,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、小牛血清白蛋白(BSA)，这三种试剂按一定比例配比，就构成封闭试剂(Den-hardt)。

预杂交操作是将印迹后的固相膜放在含有封闭剂的预杂交液中，于37～42℃温育3～12h。

杂交：预杂交结束后，取出杂交袋，在杂交袋的一角剪开一个缺口；然后加入标记好并变性的探针，排除气泡，封口；65℃保温摇床过夜。

洗膜：洗膜是指将杂交后的固相膜依次用不同浓度的洗膜液漂洗，以除去游离的及在非特异性位点上结合的探针的过程。洗膜液的温度、离子强度和洗膜时间是影响洗膜效果的三个主要因素。洗膜温度的确定应以使非特异性杂交体离析，而特异性杂交体保留为标准。通常采用低于特异杂交体T_m值12～20℃的温度洗膜。离子强度影响杂交链的稳定性，一般采用2×SSC～0. 1×SSC溶液洗膜，另外，洗膜液中还经常加入5％的SDS以促进非特异性杂交链的解离。降低洗膜液中的离子强度可提高洗膜效果。洗膜时间要根据洗膜效果来定，对于放射性标记的探针，洗膜过程中要用盖革记数器检测膜上的放射性强度，当放射性强度明显下降，膜上无DNA区已无明显的放射性信号检出时洗膜完成。

(6)杂交信号的检出。放射性标记的探针通过放射自显影检出。非同位素标记的探针则根据标记物的特有性质检出。

放射自显影：将洗好的杂交膜用保鲜膜包裹，装入暗夹，在暗室中于膜上压一张X射线片，并用两张增感屏将膜与X射线片夹住；然后，将暗夹盖紧，置于-20℃或-70℃放射自显影。

Southern杂交信号的检出主要使用X射线片。需要注意的是，放射自显影应置于低温条件，并应保持干燥和注意隔氧。放射自显影后的X射线片与其他曝光的光学胶片一样需经显影、定影、水洗处理。

定影后乳胶中会残留一些定影液，如不用水冲去，保存日久则银粒变黄、退色。充分水洗后才能使自显影像保持长久。

非放射性标记探针的检出采用酶反应检出法，目前大多数非放射性探针的制备都是采用分子杂交与酶反应相结合的策略。杂交后杂交信号的检出依赖于酶反应。除酶直接标记的探针可直接通过酶反应检测外，其他的非放射性标记物，如生物素、地高辛等标记探针的杂交信号均不能直接检出，要先使杂交体与酶标记的检出系统特异结合后，再通过酶反应间接检出。

间接检出过程包括偶联反应和酶的显色反应两个阶段。第一阶段是使杂交体与检出系统专一偶联。偶联主要通过免疫机制或亲和机制来完成，有时也将这两种作用结合起来。当探针的标记物为半抗原时，则通过抗体与抗原特异结合的免疫反应实现偶联。例如，地高辛标记的探针，将碱性磷酸酶连接在抗地高辛配基的抗体上构成检出系统。该系统中的抗地高辛配基的抗体与地高辛配基抗原专一结合，从而使碱性磷酸酶与杂交体偶联。当标记物有某种特异亲和物时，可通过亲和机制实现偶联。例如，对于生物素标记的探针，可将酶连接在抗生物素蛋白上构成检出系统。抗生物素蛋白与生物素亲和结合使酶与杂交体偶联，此为直接亲和法。有人采用的间接亲和法或间接免疫一亲和法检出系统更加复杂。

第二阶段是显色，通过酶反应生成不溶的有色产物将杂交信号检出。目前最常用的酶有碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶，也有使用β-半乳糖苷酶和酸性磷酸酶的报道。