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外源基因的表达检测

发布时间:2017-11-27 00:00 作者:中国标准物质网 阅读量:1875

(一)Northern杂交

转基因植株中外源基因的转录可以通过细胞总RNA或poly (A) mRNA与探针的分子杂交来分析,它是研究转基因植株中外源基因表达及调控的重要手段。

原理:整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达,则转化植株细胞内有其转录产物—特异mRNA的生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离,则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上;将它们原位转移到固相膜上;在适宜的离子强度及温度条件下,用探针与膜杂交;然后通过探针的标记性质检出杂交体。若经杂交,样品中无杂交带出现,表明虽然外源基因已经整合到植物细胞染色体上,但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。

同Southern杂交一样,Northern杂交是将RNA或mRNA样品进行电泳分离然后转移到固相膜上,再与探针杂交。它可对外源基因的转录情况进行较详细的分析,如RNA转录体的大小及丰度等。

Northern杂交程序也分为三大部分:①植物细胞总RNA的提取;②探针的制备;③印迹及杂交。

1.植物RNA的提取

植物细胞RNA提取中的主要难题是如何防止RNase的降解作用。RNase是一类水解核糖核酸的内切核酸酶,它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同,不仅生物活性十分稳定,而且耐热、耐酸、耐碱,作用时不需要任何辅助因子,它的存在非常广泛,除细胞内含有丰富的RNase外,在实验环境中,如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液,甚至灰尘中都有RNase的存在。因而内、外源RNase的降解作用是RNA提取中的致命问题。

(1)总RNA的提取。RNA的提取方法有很多,但概括起来,分离过程主要包括以下步骤:①破碎细胞;②用酚及去污剂SDS或Sarcosyl破碎细胞膜并去除蛋白质;③酚、氯仿反复抽提纯化核酸;④LiCI选择性沉淀去除DNA及其他物质;⑤ 3mol/L乙酸钠(PH6)沉淀RNA;⑥ CsCI密度梯度离心,去除多糖等杂质,纯化RNA。

目前用于Northern杂交的植物总RNA提取方法有Trizol试剂盒法、苯酚法、异硫氰酸肌法及氯化锂沉淀法。Trizol试剂盒法操作简单方便,抽提的RNA的质量高,但成本高。具体操作见说明书。

(2) mRNA的分离。从总RNA中分离mRNA主要是利用亲和层析的原理。植物mR-NA的3'端具有poly (A)结构,可用oligo (dT)-纤维素[寡聚(dT)-纤维素]或poly(U)-sepharose[多聚(U)-琼脂糖]亲和层析技术来纯化mRNA。总RNA在流经寡聚(dT)-纤维素层析柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA 3'端poly (A)残基与连接在纤维素柱上的寡聚(dT)残基间配对,形成氢键,使mRNA被吸附在柱上。不具poly (A)结构的RNA不能发生特异性结合而从柱中流出。结合在柱上的mRNA可以用低盐缓冲液或蒸馏水洗脱。因为在高盐溶液中碱基间的氢键稳定,在低盐状态下易解离,随打破poly (A)与(dT)间的氢键,使mRNA洗脱。

层析中涉及两种缓冲液:第一种为上样缓冲液,也有人称为结合缓冲液,由Tris-HCI,EDTA,氯化物盐类及去污剂组成。第二种是洗脱缓冲液,除Tris、去污剂的浓度减半外(也有Tris浓度不减半的),最大的变化是不含氯化物或含低浓度的LiCI。其作用是解除poly(A)与寡聚(dT)的结合,使mRNA洗脱下来。

(3) RNA样品质量检测。用于Northern杂交的RNA样品应是纯净的,无明显的DNA、蛋白质污染,无小分子有机物,无提取试剂的污染,分子完整,无严重降解。

RNA样品质量检测同DNA样品质量检测相同,主要有紫外吸收法及琼脂糖凝胶电泳法两种,详细过程见相关说明书。

2.探针制备

杂交探针选定:检测外源基因转录的mRNA应使用同源DNA探针。研究基因表达调控时常以报告基因表达为对象,使用报告基因做探针。探针标记物及标记方法与Southern杂交相同。

3.印迹与杂交

Northern杂交程序中除第一步—总RNA或mRNA变性凝胶电泳分离与Southern杂交不同外,其他步骤与之相同。
RNA电泳时必须解决两个问题:一是防止单链RNA形成高级结构,故必须采用变性凝胶;二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用。

(1)变性凝胶电泳。变性剂有甲醛乙二醛、羟甲基汞、尿素甲酰胺。尿素和甲酰胺会引起琼脂糖固化,不利于制胶。最常用的变性剂是甲醛乙二醛

甲醛变性凝胶电泳:甲醛琼脂糖变性凝胶分离效果好、操作简便,能分离较高浓度的RNA样品。但使用前要检测其pH,低于4.0时不能使用。制备时,先称取琼脂糖,加入DEPC处理的重蒸馏水,加热融化,当溶胶温度降至50℃左右时加入甲醛及其他成分,也可直接加入缓冲液,加热融化,当溶胶温度降至50℃后再加甲醛

乙二醛变性凝胶电泳:乙二醛易氧化,因此使用前需经强酸、强碱混合树脂处理,以除去其中的乙二酸乙醛酸甲酸等各种水合物及氧化物。配制时,称取琼脂糖,加入磷酸钠缓冲液加热融化,当溶胶温度降至50℃时加入乙二醛后倒胶。为防止胶中的RNase活性,有人采用在胶降至70℃时加入10mmol/L碘乙酸钠的做法。

(2)样品及样品量。一般Northern杂交的植物总RNA用量为10~20ug或mRNA 0.5~3.0ug。与前面介绍的检测方法一样,实验要有严格的阳性对照及阴性对照。为确定电泳分离的RNA分子的大小,还需要有分子质量标准样品。

(3)电泳条件。RNA变性胶电泳时一般使用低电压(3~4V/cm)。RNA电泳过程中要注意监测电极液的pH,由于电极缓冲液的缓冲容量有限,电泳一段时间后两电极槽中缓冲液的pH会发生变化,而pH超过8时,会引起甲醛-RNA、乙二醛-RNA复合物的解离,因此在RNA变性电泳过程中,要不断循环缓冲液,无循环设备时,每隔半小时更换一次缓冲液或混合两槽的缓冲液。

(4)染色。甲醛变性凝胶电泳时上样缓冲液中可加入一定量的EB,电泳后胶可以直接放紫外光下观察、照相。如果条带不清晰,可先将胶浸泡在0.1×SSC溶液中约20min,以除去甲醛,然后再将胶置于含0.5ug/mL EB的0.01×SSC溶液中染色20min。对于丰度低的RNA及乙二醛变性时,采用电泳后染色。

(二)RT-PCR检测

1992年Larrick报道了用反转录PCR (reverse transcribed PCR, RT-PCR)方法检测外源基因在植物细胞内的表达。其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行反转录,然后再经PCR扩增,如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA扩增带,则表明外源基因实现了转录。

反转录有两种做法:一种是以oligo dT作引物,合成出各种mRNA的cDNA第一链,然后加入特异引物,利用DNA合成酶扩增出特异的DNA片段;另一种是以mRNA 3'端的互补序列为引物,进行反转录,得到特异的cDNA,再加入3'端及5'端的引物,进行PCR扩增,得到特异cDNA的扩增带。

该方法简单、快速。但对外源基因转录的最后确定,还需与Northern杂交结果结合起来分析。

(三)Western杂交

1. Western杂交原理

在证明外源基因表达出特异的mRNA后,还需要进一步证明表达出的mRNA能翻译成特异蛋白质。若外源基因的表达产物是一种酶,则可以通过测定转化植株中该酶活性来达到检测该外源基因表达情况的目的。若表达产物不是酶,就要采用免疫学方法检测。

Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法。其原理是:转化的外源基因正常表达时,转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离,将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜上,膜在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭非特异性位点。然后加入特异抗体(一抗),印迹上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后,再加入能与一抗专一结合的标记的二抗,最后通过二抗上标记化合物的性质进行检出。根据检出结果,可得知被检植物细胞内目的蛋白表达与否、表达量的高低及大致的分子质量。

2. Western杂交程序

Western杂交全过程包括转基因植物蛋白质的提取、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质、蛋白质条带印迹、探针制备、杂交与杂交结果的检出6个步骤。

(1)植物蛋白质的提取。提取过程中要保持蛋白质分子的结构完整。Western杂交的蛋白质样品一般不需要制备出来,粗提液即可。植物细胞的功能蛋白绝大多数都能溶于水、稀盐、稀酸和稀碱等溶液,其中稀盐溶液和缓冲液对蛋白质稳定性好、溶解度大,在提取时最为常用。

提取的第一步是细胞破碎,可以采用核酸提取时的液氮冷冻研磨法,也可以采用砂或氧化铝研磨,加入大致为样品体积的3~6倍提取缓冲液制成匀浆后离心,上清液为总蛋白样品液。如果目的蛋白含量极微可经透析或用PEG浓缩。
(2) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白质。PAGE是根据蛋白质所带的电荷多少及分子大小两个因素来分离蛋白质的。当要想通过电泳来测定蛋白质的分子质量时,单纯的PAGE不能达到目的,必须消除蛋白质分子的电荷因素,需采用SDS-PAGE电泳。其原理是用SDS处理蛋白质样品,使亚基解聚,在二硫苏糖醇(DTT)或片巯基乙醇存在时,二硫键还原,多肽链由特定的三维构象转变成松散的伸展状。SDS阴离子与松散多肽链结合,平均每克蛋白质结合1. 4g SDS。由于SDS带有大量的负电荷,样品中的各种蛋白质与SDS结合后,都带上大量的负电荷,这样各蛋白质分子间原有的电荷差异就被掩盖,只剩下分子质量上的差异。这时,蛋白质分子的电泳迁移率就只取决于它们的分子质量。SDS-蛋白质复合物在水溶液中呈长椭圆棒状。不同分子质量的蛋白质与SDS形成的复合物,短轴相同、长轴与分子质量呈正比,分子质量为1×104~2×105,复合物的迁移率与分子质量对数呈线性关系。用一组已知分子质量的蛋白质作为标准,以标准蛋白的迁移率对分子质量对数作图可得标准曲线。利用标准曲线可求出在相同条件下进行电泳的蛋白质样品的分子质量。

为提高SDS-PAGE的分辨力,在均一浓度基础上又发展出SDS-PAGE梯度凝胶电泳—蛋白质分子在电场作用下沿浓度由低向高的凝胶泳动。泳动过程中凝胶的孔径越来越小,蛋白质分子所受阻力越来越大,不同大小的蛋白质颗粒将分别被阻滞在孔径与其分子大小相当的凝胶区段。样品中分子大小相同的同一组分将在电泳的过程中逐步集中在凝胶的同一区段,而得以浓缩,形成狭窄而清晰的条带。谱带一旦形成后,其位置不因电泳时间延长而改变,这一点很适合印迹的要求。此外,梯度凝胶电泳的另一个优点是同一块胶分离蛋白质的分子质量范围增大,如一块4%~30%梯度的凝胶可同时分离分子质量为5×104~2×106 Da的不同蛋白质。

电泳方向为负极向正极。样品在浓缩胶中,使用较低的电压;当进入胶后,就可以提高电压。电泳时间一般为4~5h。

(3)蛋白质条带印迹。蛋白质印迹是指利用某种动力(毛细作用、扩散作用或电动力),将经SDS-PAGE电泳分离的蛋白质谱带由凝胶转移到固相膜的过程。

A.固相膜的种类。蛋白质印迹使用的固相膜有硝酸纤维素膜、重氮化纤维素膜、阳离子化尼龙膜(Zeta-探针膜)和DEAE-阴离子交换膜。

硝酸纤维素膜(NC膜)使用最广泛。它可能是通过疏水作用与蛋白质非共价结合,结合容量为80ug/cm2。该膜的价格便宜,使用时无需活化。在pH8.0时,蛋白质较易吸附于膜上。存在的问题是小分子质量的蛋白质与NC膜的结合力较差。

B.印迹方法。印迹方法有电印迹法及扩散印迹法两种,目前多采用电印迹法。该法优点在于经电泳转移,蛋白质可被浓缩地印迹在固相膜上,不产生扩散,而且原凝胶中的SDS,巯基乙醇等干扰测定的物质在电转移时可被除去,蛋白质能恢复其天然构象及生物活性,从而可以使用酶标抗体以及放射性标记的抗体灵敏地检测出极微量的抗原。

电转移后的凝胶需用印迹缓冲液洗涤、平衡,以除去胶中的SDS,并使胶的pH及离子强度与印迹缓冲液一致,防止胶变形。固相膜、滤纸需用印迹缓冲液平衡。滤纸、胶、膜、滤纸各层之间要贴紧。膜一旦与凝胶接触后,就不要再拿起,仔细排除各层之间的气泡。凝胶一边接负极,固相膜一侧接正极。印迹通常采用pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液(含20%的甲醇)。在进行快速转移及转移大分子蛋白质时应注意进行有效的冷却。电泳时采用恒定电流20~100mA,电泳4~16h。转移后可用考马斯亮蓝染液染凝胶,检查转移是否完全。为确定检出的蛋白质的分子质量,有人采用将NC膜置丽春红S溶液中染色,然后照相,记录分子质量条带的位置后,再用水洗,使滤膜脱色后进行杂交。

(4)探针制备。探针是针对目的蛋白的抗体,又称为一抗。一抗探针的质量是影响杂交效果的主要因素之一。只有得到特异性强、效价高的抗体,目的抗原的检出才能达到一定的灵敏度。一抗可使用由目的蛋白制成的抗血清或单克隆抗体。

Western印迹杂交使用的一抗一般不标记,与一抗结合的二抗带有特定标记。标记物有放射性及非放射性两种。放射性标记主要使用125I ,32P等。非放射性标记主要是酶。酶标记中最常用的是过氧化物酶及碱性磷酸酶。酶可直接连接在二抗上,如碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG。有时酶标记物不直接连在二抗上,而是二抗与生物素相连,酶与抗生物素蛋白相连,通过生物素与抗生物素的特异结合,使酶与二抗相连。不管那种机制,目的蛋白的最终检出还是通过放射自显影或酶的显色反应来完成。有关知识已在前面做了介绍,此处不再重复。总之Western印迹的检出过程较复杂,要通过一系列的抗原一抗体的免疫反应、大分子与配基的亲和反应、酶催化的显色反应使转移到固相膜上的目的蛋白显示出来。

(5)杂交与杂交结果的检出。杂交与检出包括封闭、第一抗体反应、第二抗体反应、显色4步。

封闭也称猝灭。由于探针多是蛋白质,很容易与固相膜结合。加入探针后,探针不仅与结合在膜上的特异蛋白质(抗原)结合,而且也与膜上未结合蛋白质的部位结合,造成很高的背景,使检出的灵敏度下降。因而在未加入探针之前必须将膜上的空白部位封闭。方法是将印迹后的膜浸泡于一种非特异性蛋白质溶液中,使这种蛋白质与膜上空白部位结合,然后再加入探针,探针就只与特异蛋白质结合,消除了背景。此操作在印迹术中称为猝灭。小牛血清白蛋白(BSA)、血红蛋白、酪蛋白、卵白蛋白、白明胶、脱脂奶粉及非离子去污剂(如Tween-20)等都可作为封闭剂使用,应根据实验材料及实验方法加以选择。

封闭后的固相膜经缓冲液洗涤后,加入第一抗体,于37℃轻轻摇动,保温1h,或室温条件下保温2~3h,还可采用4℃过夜的做法。可根据具体情况而定。结合了第一抗体的固相膜经洗涤后加入适宜浓度的二抗,于室温或37℃轻摇保温1h。封闭及与一抗、二抗反应均在密封的塑料袋中进行。此步的关键是反应时间及洗膜程度。最后的显色是加入酶反应的底物,摇动至固相膜产生色带。此步关键是掌握好特异条带颜色及背景的关系。一般显色至背景刚刚出现为止。显色后的膜用蒸馏水漂洗后晾干,照相。千燥后的膜可以封入塑料袋中保存。图11-4显示一个Western杂交结果。

图11-4转基因植株表达的Western杂交检测

M.分子质量标记;C.原品种对照;1×Bt与4×Bt为杂交信号强度标带;1~7为转基因阳性植株

(6) Western杂交实验设计。实验中必须设置两个负对照和一个正对照。负对照包括以免疫前血清作为不与目的蛋白反应的负对照和完全不含目的蛋白的同类蛋白制品的负对照,负对照用来确定非特异性蛋白条带;正对照是含已知量目的蛋白的同类蛋白制品,正对照可确定被检样品中目的蛋白的位置,并估计大致的含量。

根据被测蛋白质的分子质量确定使用的凝胶浓度,20kDa左右的蛋白质一般使用15%的分离胶和5.4%的浓缩胶。检测的各样品量为1~100ug。上样前加入含4% SDS的上样缓冲液,95℃加热3min。电泳条件采用稳流30mA,电泳至蛋白质充分分离。

免疫学试剂应选择用变性目的蛋白免疫的高滴度的多克隆抗体,或单克隆抗体混合物。不过在多数情况下往往只需根据现有抗体来设计实验。

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