基因工程是20世纪70年代诞生并迅速发展起来的一项生物领域的高新技术，又称为重组DNA技术、遗传工程或转基因技术。其主要原理是按照人们的意愿，将某种生物的基因(外源基因)进行人工分离和体外重组后，导入到另一种生物体的基因组中，有目的地改变后者的遗传性状。经基因工程修饰的生物体在媒体上常被称为遗传修饰过的生物体(geneti-cally modified organism, GMO)，主要包括转基因植物、转基因动物和转基因微生物三大类。最近20多年来，全球通过基因工程技术开发了大量的、涉及众多领域的基因工程产品，给人们的生产和生活带来了巨大变化。

PCR是聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)的简称，由美国科学家Mullis于1984年发明，已经成为当今分子生物学研究的主要技术。它是模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行的特异DNA序列扩增。它可以在一只小离心管中，短短的几小时内使某特异DNA片段扩增数百万倍，所需的DNA模板量少，而且DNA粗提物就可得到良好的扩增结果，因而这一技术为外源基因整合的检测提供了便利的条件，尤其是在转化材料少又需及早检测的时候。

1. PCR技术原理

PCR技术是模拟体内DNA复制合成过程，在体外进行的特异性扩增某DNA片段的方法。原理是利用DNA聚合酶能够以引物3'-OH为起点，催化dNTP按模板顺序，合成模板互补链。根据这一原理，在体外进行目的片段扩增时，只需设计两个特异引物，由目的片段的双链DNA(即模板DNA)与设计的引物、4种dNTP的等量混合物、DNA聚合酶、缓冲液构成扩增系统，就可以快速扩增目的片段。

具体步骤：首先在高温(92～95℃)条件下使模板DNA变性，解开双链模板，然后降低温度(40～60℃)，使两个引物分别与单链模板中目的片段3’端互补区退火，形成局部双链区，将温度升至72℃，聚合酶把单核苷酸从引物的3‘端掺入，多核苷酸链根据模板的顺序按5'→3’的方向不断延伸，形成互补双链。由于两个引物3'端相对，所以双引物合成结果是形成了目的片段的特异扩增产物。这样经变性、退火、延伸三步构成一个循环；一个循环之后，目的基因扩增1倍。如此进行20～30个循环，目的片段被大幅度地扩增(图11-1)。

图11-1PCR反应示意图

利用PCR扩增检测外源基因整合时，要以被检组织DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。若被检植株基因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。非转化植株基因组DNA中不含有外源基因，则无特异性扩增条带出现。通过特异性扩增条带的有无及其分子质量的大小可对外源基因是否整合作出初步判断。

2．引物设计及合成

用于PCR扩增的引物一般为15～30个核苷酸，主要通过人工合成获得。高效而专一性强的引物是特异性扩增的关键。引物设计的基本原则是：①引物中的G+C含量应为45％～55％; (2)4种碱基应随机分布，避免单一碱基的连续排列；③防止引物内部形成二级结构；④两个引物之间不应发生互补，尤其在引物的3‘端要避免“引物二聚体”形成；⑤3‘端末位碱基尽量不要选用A。

扩增外源基因的引物设计在不严重违反上述原则时，最简单、但不失为有效的方法是，以该目的基因5’端的20个碱基序列作为5’端引物，以该基因3’端20个碱基顺序的互补序列作为3’端引物，扩增的产物即为该基因。一般情况下，在设计外源基因整合的检测引物时，应该利用计算机程序设计。

3．模板DNA的制备

PCR对模板DNA的质量要求不高，有时可以简单到直接利用细胞裂解液。但是由于细胞裂解液中DNA成分复杂，目的序列浓度相对又很低，这不仅会造成特异扩增产物量不足，而且产生错误的机会增多，所以对外源基因整合的检测，一般还要求制备出植物基因组DNA或总DNA。

植物基因组DNA的制备方法可以采用快速微量法，常用的有CTAB微量提取法和SDS微量提取法。检测时要有阴性对照及阳性对照，所以需分别从转化植株及非转化植株中以同样的方法提取基因组DNA。

4．反应体系

PCR反应体系包括以下成分。

(1) Taq DNA聚合酶：1986年，Erlich从生活在温度高达70～75℃环境中的一种水生嗜热菌T. aquaticus YT-1中纯化出耐热的DNA聚合酶，称为Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的第一个特点是具有较高的热稳定性，在高温下酶活性的半衰期为：92.5℃130min,95℃ 40min, 97℃ 5min。该酶在PCR循环中可一直保持较高的活性。该酶的第二个特点是在相当宽的温度范围内都能催化核苷酸聚合，但速度有所不同，在70～75℃其活性最高。不同温度下的Kcat值(每个酶分子每秒钟可延伸的核苷酸数目)大致为：75～80℃ 150个、70℃ 60个以上、55℃ 24个、37℃ 1.5个、22℃ 0.25个。温度超过80℃时，核苷酸聚合速率明显下降，90℃条件下核苷酸聚合几乎不能进行。该酶的第三个特点是没有3’→5’的外切核酸酶活力，因而对核苷酸的错误掺入不其校正功能，这也是Taq DNA聚合酶的致命缺点。在使用该酶的PCR扩增反应中，每次循环碱基错配的概率约为2×10^-4。尽管Taq酶对错配碱基没有校正功能，但对错配的引物一模板的延伸效率却大大地低于正确的引物-模板，因而Taq DNA聚合酶的PCR产物仍具有较高的DNA序列的忠实性。该酶与其他DNA聚合酶相同，都是Mg²⁺依赖性酶，其活性对Mg²⁺浓度十分敏感。

(2)模板DNA：适宜的模板量是保证特异性扩增的前提。模板DNA的量需根据其分子质量大小来确定，一般需含有10²～10⁵个被检基因拷贝。植物基因组越大，检测单拷贝外源基因时需要的样品量越多。但要注意，模板过量会降低扩增特异性。

(3)引物：引物浓度不宜偏高，一般为0.1～0.5umol/L。引物浓度过高会产生两个问题，一是易引起错配和产生非特异性扩增，二是易生成引物二聚体。对转基因植株鉴定来说，这一点很重要，因为植物基因组很大，而单拷贝的外源基因在基因组中所占的比例很小，DNA提取又很粗放，这时若引物浓度过高，非特异性扩增极易发生。

(4) dNTP：与其他酶反应相同，底物dNTP浓度越高，则聚合反应速度越快。但对于PCR反应来说，dNTP浓度过高，碱基的错误掺入率则增加，低浓度的dNTP有利于提高扩增的特异性。另外，反应中4种底物的浓度(当量数)应相同，若其中1种核苷三磷酸的浓度明显与其他3种不同时，不管是大于还是小于，都会诱发核苷酸的错误掺入，降低合成速度，以至过早终止延伸。

dNTP的终浓度一般为50～200umol/L。由于底物核苷酸溶液具较强的酸性，使用时应将底物原液用NaOH调至pH7. 0，这样才能保证扩增时反应体系的pH不低于7.1。

(5)缓冲液：PCR反应缓冲液一般含有10～15mmol/L Tris-HCI, 50mmol/L KCI,1.5mmo1/L MgCl₂。缓冲液的pH在室温下应为8.4，在聚合反应的温度条件下(72℃)其pH为7.2。缓冲液中Mg²⁺的浓度对反应十分重要，它影响引物的退火程度、模板与引物链的解链温度、酶的活性、产物的特异性及引物二聚体形成等诸多过程。Mg²⁺浓度过高时非特异性扩增产物增加，浓度低时则产物量下降。因此，适宜的Mg²⁺浓度是扩增成败的关键。反应体系中的EDTA及磷酸根会影响Mg²⁺浓度，来自模板DNA溶液中的EDTA能与Mg²⁺离子鳌合，使其浓度下降。所以应考虑DNA样品中的EDTA浓度，若样品中含有EDTA或其他螯合剂时，就要适当增加反应体系中的Mg²⁺浓度。磷酸基团主要来自dNTP，其分子中的磷酸基团能定量与Mg²⁺结合，所以反应体系中dNTP的浓度将直接影响Mg²⁺浓度。标准反应中，4种dNTP浓度各为0.2mmol/L，总浓度为0. 8mmol/L,1.5mmol/L MgC1₂中未与dNTP结合的只有0.7mmol/L。一般原则是反应中Mg²⁺的终浓度至少要比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/ L。缓冲液中的KCl的最适浓度为50mmol/L,高于75mmol/L时PCR反应明显受抑制。

(6)其他成分：反应体系中还含有100ug/mL的白明胶或BSA，也有加入非离子去污剂Triton X-100或Tween 20的，其目的是稳定Taq DNA聚合酶。为防止反应时液体挥发，反应体系的液面上加有矿物油。使用具加热帽的PCR仪时，可不必加矿物油。

5．循环参数

PCR扩增中，变性、退火、延伸三步构成一个循环。这三步分别在三种温度条件下进行，由PCR扩增仪自动完成。
(1)变性：第一轮循环前有一个较长时间的变性，其目的是让双链模板DNA充分解链，以及使样品DNA中含有的少量蛋白质变性失活。模板DNA充分变性对于扩增反应非常重要。对于多数DNA来说，使双链DNA完全解链的温度为94℃左右，所以常采用在加入底物及酶前先使模板DNA在94℃以上变性5～10min，迅速冷却后再加入dNTP及Taq DNA聚合酶。当然，也可将反应物一次性全部加入，先进行几次长时间变性(2～3min)的循环，使模板充分变性后再缩短变性时间。循环中的变性时间一般不宜太长，多采用94℃ 30s至1min。

(2)退火：退火的温度及时间取决于引物的长度、G+C含量、引物浓度及引物与模板的配对程度。一般退火温度比引物Tm值约低5℃。引物的Tm值可按下式估算：

Tm＝4(G+C)+2(A+T)

A, T, C, G为4种碱基的数量。

退火温度越高，所得产物的特异性越强，因而提高退火温度，可提高PCR扩增的特异性。需要注意的是退火时间不宜过长，过长也会影响反应的特异性。在标准反应中，引物的量是过量的，退火过程只需几秒钟就可完成。但一般PCR扩增中退火时间常设置在30s至2min，主要目的是使整个反应达到所需的温度。

(3)延伸：延伸温度是由使用的聚合酶的最适活性温度决定的。Taq DNA聚合酶在70～75℃具最高活力，并有较强的稳定性，所以使用Taq DNA聚合酶时，延伸温度多选用72℃。延伸时间应根据待扩增片段的长度及原始浓度确定，在标准反应体系中，Taq DNA聚合酶合成速度大约为每分钟催化2000个核苷酸掺入，2kb长的模板1～1.5min的延伸时间就可以了。确定延伸时间的一般原则是，在保证目的序列合成完整的前提下，延伸时间越短越好。

在循环结束后，应设置一次较长时间(8min左右)的延伸，以保证扩增出来的片段都延伸完整。

(4)循环次数：循环次数主要取决于DNA模板的浓度及待扩增片段(目的片段)在模板中的含量，如果扩增体系中目的片段的起始分子数目很少，增加循环次数，可明显增加产物量。但PCR扩增反应并不是无限的，在循环的起始，产物呈指数级数增长。但经过一定次数的循环后，产物不再呈指数增长，而是进入线性或静止状态，即进入平台期。多数情况下，PCR扩增的平台期是不可避免的，它的出现源于随反应进程而发生的反应体系内各成分浓度的相对变化，如酶活性的下降、dNTP浓度的降低、产物积累、非特异性产物的竞争抑制以及产物退火等。扩增反应应该在平台期到来之前停止，因一旦进入平台期，非特异性扩增产物就会明显增加。

6．扩增产物检测

扩增反应后，将反应物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳(当目的片段小于100bp时)分离，经溴化乙锭染色，置紫外透射仪观察，若凝胶上出现明显条带即为扩增的产物。根据Ladder确定条带的分子质量，分子质量与目的片段相同的条带为正确的特异性扩增产物，可初步判定外源基因已经整合进植物基因组。图11-2为利用PCR检测转基因阳性植株的电泳图。图中显示原受体品种和阴性对照植株无PCR扩增带，而转化载体和转基因阳性植株有扩增带。

图11-2转基因阳性植株的PCR检测

M. marker; C．阴性对照；P．质粒(阳性对照)