活细胞可以摄取中性红（每毫升生长液中含有40 ug )，并且将其储存于溶酶体中，但是死细胞是不能摄取中性红的。定量检测中性红，可以先用甲醛固定细胞，然后用醋酸乙醇溶液溶解染料，再用Elisa读板仪在570nm处读数。然而，中性红是容易沉淀的，因此含染料的生长液通常需要温育过夜和在使用前进行离心。这种分析方法虽然不能测出细胞的总数，但是吸光值的下降与活细胞的损失相关，而且也容易进行自动化测量。

【材料】

1. 96孔细胞培养板培养的待测细胞及其对照细胞孔。

2．中性红溶液。将中性红用BSS或培养液溶解，制备成40ug/L的染色液。

3．细胞固定液。醋酸和甲醛的混合物，各含1%。

4．中性红提取液。醋酸和乙醇的混合物，含醋酸1%，乙醇50%。

5.酶标仪。

【方法】

1．用96孔板培养细胞，包括待测细胞和对照细胞。

2．吸去培养液，在每孔中加入0.1 ml的中性红溶液，然后继续培养3小时，倒掉中性红溶液。

3．每孔中加入甲醛和乙醇混合物固定液0.2ml固定5分钟，然后倒掉固定液。

4．每孔加入中性红提取液0.1 ml 。

5．在测定波长570nm、参考波长650nm比色。

【结果与分析】

细胞对中性红的摄取率越高，则细胞毒性越小；反之则表明细胞毒性越大。

【注意事项】

1．虽然短期试验很方便，容易操作，但是他们只能表示在试验当时细胞是死细胞，也就是中性红可以渗透的细胞。然而受毒性影响的细胞，死亡可能经过数小时或一天以后，这种情况下则应用长时间检测法较好。有的细胞在一定的药物剂量下，损伤可能是可逆的，并未彻底的死亡。总之检测存活细胞试验的性质是不同的，用长短相结合的方法检测更适宜。

2．在加入中性红提取液之前要将培养板中残留的中性红彻底的清洗干净，以免造成对最终结果的影响。

MTT试验

【原理】

噻唑蓝（methylthiazoletetrazolium, MTT）是一种浅黄色粉末，可以溶解于生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS)之中，但是溶解度不高并且缓慢。在一定浓度下（在培养基中的终浓度为0.5 mg/ml )，细胞可摄取MTI并被线粒体脱氢酶（主要是琥珀酸脱氢酶）氧化为蓝紫色甲臜颗粒并沉积在细胞中，各孔颗粒产生量与活细胞数成正比，该颗粒在培养基中不溶，可用溶解液将其溶解，然后进行比色定量比较。用各受试物浓度组的吸光度值与对照组相比得出的百分率作为各受试物浓度组的细胞存活率，通过设计合理的一系列剂量得出的细胞存活率，可计算受试物对细胞的半数抑制浓度（IC50)，比较不同药物的IC50可知细胞对不同受试物的敏感性。

【材料】

1．待测细胞培养物（经受试物作用后），设对照组。

2．细胞培养液。

3. MTTMTT浓度为5 mg/ml，称取MTT0.5克，溶于l00ml的磷酸缓冲液（PBS)或无酚磺酞的培养基中，用0.22 um滤膜过滤以除去溶液里的细菌，4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

4．二甲基亚砜(DMSO)。

5.酶标仪。

【方法】

1. 0.25％用胰蛋白酶消化单层细胞，并且将细胞收集到含有血清的培养基之中。

2．离心细胞悬液5分钟，使细胞沉积下来，并用培养基重悬细胞，计数。

接种细胞：用培养液配成单个细胞悬液，将200ul的培养基加至第一列与第12列的8个孔中。为了将“边缘效应”减至最小，边缘孔用无菌的PBS填充。

3．培养细胞。可以根据实验的目的和要求决定时间的长短。

4．用培养基将待测药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。选择浓度时应该以最高浓度下大多数细胞被杀死，而最低浓度时不会将细胞杀死为标准。一般情况下，每种药物使用3块培养板，这样一次试验中便可以有三个平行测定结果。

5.在2～11列的8个孔中分别加入200ul的新鲜培养基，将这些细胞作为对照。

6．在3～10加入细胞毒性药物。每个药物浓度4个孔，这样A～D行可用第一种药物，E～H可用第二种药物。

7．将药物溶液移至5cm培养皿中，用4道加样器向每组的4个孔中分别加入200ul。

8．将培养板放回，温育至确定的时间。

9．在药物作用期结束时，去除所有的含有细胞孔中的培养基，然后加入200ul新鲜培养基。若是非黏附细胞，离心培养板使细胞沉淀下来。

10．在生长期末，每孔中加入200ul新鲜培养基，在1～11列每孔中各加入50ul的MTT。

11．用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境下温育4小时，可延至8小时。

12．小心吸去孔中的上清液，然后加入200ul DMSO，振荡10分钟，使MTT-甲臜溶解。

13．选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光值，记录结果。以药物浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制曲线。第二列和第十一列各孔中得出的平均吸光值作为对照吸光值，对照组吸光值减少一半时间所需的药物浓度为IC₅₀浓度。

【结果与分析】

细胞存活率越高，则说明化学物的细胞毒性越小。

【注意事项】

1．培养板在接种细胞时应留出空白孔，空白孔除了没有细胞外，其他处理与其他孔一致，酶标仪在测定吸光度值时自动将空白孔的本底值减去，使之为0。

2．当细胞培养液中含高浓度还原物时，比如5mM的维生素C，在加入MTT使用液之前应洗涤。方法是：弃去培养液，加PBS, 200ul/孔，摇荡后弃去PBS，重复2次，然后加入MTT使用液。

3．当培养板里培养的是悬浮细胞时，可直接加入MTT储备液，使其在培养基中的终浓度为0.5 mg/ml。如各孔中培养液体积为100ul，则加入MTT储备液l0ul。

4．当培养板不是96孔板时，可将颗粒溶解后转移到％孔板进行比色，或将部分细胞转移到96孔板，再进行MTT试验。

5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

6．为了避免血清干扰，一般选小于10％的胎牛血清。

7. MTT实验吸光度最后在0～0.7之间。