药物或者毒物可以使细胞受损，进而使细胞膜的通透性增强，锥虫蓝染料可以透过细胞膜而使细胞染上蓝色，但是由于活细胞拒染而不被染上蓝色。通过计算细胞的蓝染率可以估计细胞毒性的程度。

【材料】

1．受试细胞。如融化冷冻的细胞、原代离散的细胞、胰蛋白酶消化的贴壁细胞等。

2. 0.25%胰蛋白酶消化液。

3. PBSA。

4．血细胞计数板。

5. 0.4％锥虫蓝。称取4g锥虫蓝，加入少量蒸馏水研磨，然后加双蒸水至l00ml，用滤纸过滤，在4℃条件下保存。使用时，用PBS稀释至0.4％的锥虫蓝溶液。

【方法】

1．用胰蛋白酶消化或离心培养的细胞，重悬制备成高浓度细胞悬液（大约106/ml)。

2．取一个干净的血细胞计数板，并将盖玻片固定在上面。

3．将一滴细胞悬液与一滴0.4％的锥虫蓝混匀。

4．将混匀之后的溶液加到血细胞计数板的计数室内。

5．静置1～2分钟（不要太久，否则活细胞可能受损而吸收染料）。

6．在显微镜下，用10倍的物镜在计算网格处聚焦。

7．计算蓝染细胞总数和未着色细胞的总数。

8．清洗血细胞计数板，放回原处。

【结果与分析】

计算细胞蓝染率（细胞死亡率，％）和细胞存活率，见公式13-9和公式13-10。

细胞的蓝染率高则说明受试物的细胞毒性强。通过设计一系列的剂量得出的细胞死亡率可计算药物对细胞的IC₅₀，比较不同受试物的IC₅₀，可知细胞对不同药物的敏感性。IC₅₀越大，说明细胞毒性越小，反之亦然。

【注意事项】

1．常用24孔或者少于24孔的培养板，防止细胞数少而难以制备细胞悬液。

2．细胞悬液应均匀。

3．制备或者吸取锥虫蓝溶液时最好无菌操作。保持锥虫蓝溶液的无菌性，以免对试验结果造成影响。