药物或毒物可使细胞坏死或溶解，致使细胞的数目减少。细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，通过细胞的数目来反映细胞毒性的大小。

【材料】

1．血细胞计数板。

2．盖玻片。

3．移液管。

4．显微镜。

5．手揿计数机。

【方法】

1．将细胞接种到24孔板或者6孔板中，待细胞混合之后，在受试组加入不同浓度的药物，在对照组加入溶剂对照，温育24小时之后制备细胞悬液。

2．准备血细胞计数板

(1)用70％的乙醇清洗血细胞计数板。

(2）清洗盖玻片后，在将其盖到计数板之前先将其边缘沾少许水，当出现干扰图像即“牛顿环”时，则说明盖玻片已经被放到正确的位置。

3．用力吹打细胞悬液，使细胞团块均匀分散，然后吸取20ul的样品。

4．把细胞悬液移到计数板小室的边缘，利用毛细作用使之充满计数板和盖玻片的空隙。小室内的液体以液体刚好流到计数板的凹槽为准。

5．按照以上操作，使计数板的另一个小室也充满细胞悬液。

6.洇干多余的液体，将计数板放在显微镜的载物台上。

7．选择10倍物镜，利用网格线对焦。

8．移动计数板，使镜下的视野正好在整个网格区域中心的大方格。在100倍物镜下计数10个大方格中的细胞，即每个小室的中央方格和四角方格。将压在左边中线和上边中线的细胞数计数在内，而压在右边中线和下边中线的细胞不计数在内。

9．分别用70％乙醇清洗计数板和盖玻片，擦干好放回原处。

【结果与分析】

如果受试物组的细胞数多于对照组的细胞数，表明药物有促进细胞增殖的作用；反之，则表明受试物有抗细胞增殖的作用。按公式13-3～公式13-5可计算细胞的相对数。

细胞的相对数越高，说明细胞毒性越小；细胞相对数越小，说明细胞毒性越大。

【注意事项】

1．将细胞悬液充分混匀，以免造成计数结果的误差。

2．向盖玻片和计数板之间注入细胞悬液时，以盖玻片下的空隙刚被充满为准，不满或者过满都会影响计数结果。

3．计数法简便易行，但是不够准确，可能有20％～30％的误差。

结晶紫试验

【原理】

结晶紫是一种碱性染料，可以和细胞核中的DNA结合，但是药物或者是毒物可以抑制细胞的增殖，使细胞数减少，从而致颜色变浅，染色之后洗去结晶紫染液进行比色，通过细胞颜色深浅来间接比较细胞数的多少。

【材料】

1. 96孔细胞培养板培养的对照细胞和待测细胞。

2. 10％甲醇溶液。

3. 0.4％的结晶紫染液：0.4g结晶紫溶于l00ml甲醇中。

4. 33%醋酸。

【方法】

1．在96孔培养板的各孔中分别加入5x10⁵的细胞悬液（含10％小牛血清的RPMI 1640培养液），在培养箱中以37℃,5% CO₂培养细胞2～3小时，使细胞贴壁。

2．吸出培养液，用PBS小心地把细胞洗涤一次，然后每孔加入0.1ml 10％甲醇溶液固定细胞30秒。

3．吸出甲醇溶液，每孔加入0.1 ml结晶紫染液，在室温中放置20分钟。

4．轻轻甩去结晶紫染液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上将水分吸干。自然干燥或者37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。

5．测定前，每孔加入0.lml 33%醋酸脱色，充分振荡后在测定波长570nm、参考波长650nm处比色。

【结果分析】

【注意事项】

本方法吸光度值较低，仅为MTT试验和中性红试验的50％左右。