（一）抗体／补体介导的特异性细胞毒作用分离T细胞亚群（T cell subset)

【原理】

人T淋巴细胞按其表面标志分为CD4⁺T和CD8⁺T细胞两类，其细胞膜上分别有CD4和CD8分子，当它们与相应的鼠抗人单克隆抗体结合后，在补体的参与下，可溶解相应的T细胞亚群，从而分离出另一种细胞亚群。

【材料】

1．聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）；

2. Hanks液（内含5％小牛血清和1.0g/L叠氮钠）；

3．新鲜兔血清，肝素；

4．抗CD4和抗CD8单克隆抗体。

【方法】

1．常规分离人外周血单个核细胞，配成1x10⁷/ml细胞悬液。

2．取1 ml细胞悬液加入适量的抗CD4单克隆抗体，37℃孵育30分钟。

3．用Hanks液洗2次，1000r/min,10分钟，去除游离抗体。

4．加入新鲜的适量的兔血清，37℃ 1小时。

5．离心1000r/min,10分钟，弃上清液。

6．用Hanks液洗4次，获得CD8⁺T细胞，储存于4℃备用，并进行纯度和活力检测。如果用抗CD8单抗代替CD4单抗，可获得CD4+细胞。

【结果】

用该法分离的T细胞亚群活力可达到95％以上，间接或直接免疫荧光技术检测分离T细胞亚群的纯度。

【注意事项】

1．实验应在4℃下进行，以保持细胞活力。

2．每次制备的鼠抗人T细胞单抗和兔新鲜血清效价并不一致，所以每次制备后均需经过预试验确定抗体和补体的稀释倍数。

（二）盘选（panning）分离法分离T细胞亚群

【原理】

各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于聚苯乙烯平板上，然后加入细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取。同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4⁺或CD8⁺细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。

【材料】

1．聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）。

2．抗CD4和抗CD8单克隆抗体；羊抗鼠IgG抗体。

3．缓冲液Hanks液（含5％小牛血清、不含Ca²⁺、Mg²⁺);pH 9.0,0.05 mol/L Tris-HCI缓冲液；pH 7.5,0.15mo1/L PBS（含10％小牛血清）;pH 7.2,0.15mol/L PBS。

4.盐酸利多卡因（20mg/ml)。

【方法】

1．羊抗鼠IgG抗体包被聚苯乙烯平皿用Tris缓冲液稀释羊抗鼠IgG（浓度为10ug/ml)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS洗净。

2. CD8⁺细胞的分离

(1)取肝素抗凝外周血，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液法分离单个核细胞，E玫瑰花环技术分离T细胞，用Hanks液将T细胞沉淀配成（3～4)x10⁶/ml;

(2)取T细胞悬液与适量的抗CD4单克隆抗体反应，4℃反应30分钟；

(3）用Hanks液洗细胞2次，每次1000r/min离心10分钟，去除未结合的单克隆抗体；

(4)取3ml细胞悬液加入到羊抗鼠IgG抗体包被的培养皿中，室温反应1小时。注意间隔10～15分钟轻摇一次；

(5）用 5ml Hanks液轻轻洗脱下未黏附细胞，一般4次，收集的细胞（即为CD8⁺细胞）4℃存放。注意：避免用吸管直接触动平皿。

3. CD4⁺细胞的分离

(1)用Hanks液配制盐酸利多卡因，最终浓度为4mg/ml;

(2）加3～4ml利多卡因溶液到洗过的培养皿中，室温下静置10～15分钟，尖吸管吹打细胞，直到黏附的细胞全部剥脱为止；

(3)用Hanks液洗平皿，离心细胞，1000r/min,10分钟，细胞沉淀再用Hanks液洗3次，获得CD4+细胞。

【结果】

将获得的CD4⁺和CD8⁺细胞4℃保存备用，用直接或间接免疫荧光法检测分离的细胞纯度。

【注意事项】

1．为了把黏附到固体基质上而导致的非特异性结合减少到最小程度，需用无Ca²⁺,mg²⁺培养液。

2．根据培养皿底的面积适当地调节细胞悬液的体积，且需有足够的单克隆抗体吸附于塑料表面上。