实验中常需要从淋巴细胞群中分离出单一的T细胞或B细胞，以便更深入地研究T,B细胞的生物学特性和功能。目前常用的分离方法有免疫磁珠分离法和免疫吸附法，近年来应用流式细胞仪可以分离出均质性的单一细胞类型或亚群。

（一）免疫磁珠法分离T细胞和B细胞

【原理】

用特异性抗T细胞单克隆抗体与磁性小珠形成免疫磁珠（immunomangnetic beads)，这种免疫磁珠可于磁场中结合淋巴细胞悬液中的T细胞，而未结合的B细胞和其他细胞被洗脱下来。免疫磁珠法分离细胞具有纯度高（一般为95％～99%）的特点。其分离效果可媲美流式细胞仪，并具有比流式细胞仪分离术经济、方便省时、简单快速等优点。

【材料】

1．淋巴细胞悬液；

2．磁性激活细胞分离器（MACS) MACS柱（C型，可结合2x10⁸个细胞）；

3．生物素标记的磁性微珠；

4．生物素标记的抗CD4和抗CD8单克隆抗体及生物素标记的羊抗鼠IgG F(Fab)2;

5. MACS柱染色洗涤液、MACS柱洗脱液（含1％牛血清清蛋白的PBS)和MACS柱；FITC标记的亲和素；

6．培养液及试剂 RPMI 1640细胞培养液，浸湿液（含10％牛血清清蛋白的PBS)。

【方法】

1．新MACS柱需高温高压灭菌，烘干后备用。将C型MACS柱内分别用10ml注射器在柱下三通阀门处加入10ml MACS柱浸湿液，使液面达到柱内铁丝基质平面上2～3cm处，关闭柱下三道阀门备用。

2．淋巴细胞悬液（2x10⁸/ml）离心（1500r/min,5分钟），重悬于0.15ml MACS染色洗涤液中，加入生物素标记的CD4单抗和抗CD8单抗各25ul（比例为0. 05 ug/106个细胞），冰浴25分钟。用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重悬于0.15m1 MACS染色洗涤液中，加入50ul生物素标记的羊抗鼠IgG F (Fab') 2（比例为0.05 ug/10⁶个细胞），冰浴25分钟。用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重新悬浮于0.15ml MACS染色洗涤液中，加入50ul FIX标记的亲和素（比例为0.08ug/10⁶个细胞），冰浴孵育15分钟。用MACS染色洗涤液洗涤2次后（1500r/min, 5分钟），重新悬浮于0.15m1 MACS染色洗涤液中，加入生物素标记的磁性微珠（比例为5ul/10⁸个细胞），冰浴孵育5～10分钟。然后加入3m1 MACS柱洗脱液。

3．将MACS柱放入MACS磁铁槽内，用20ml MACS柱洗脱液洗柱，待液体降至柱内铁丝基质平面上2～3cm处，关闭三通阀门。将细胞悬液置于MACS柱内。在柱下放一支50ml的试管，打开阀门，使其流速为3～5m1/min，边流边加MACS柱洗脱液，每个柱内至少加柱洗脱液30ml。试管内的洗脱液中为CD4-CD8-细胞（即阴性分离）。离心洗涤后调整细胞至所需浓度备用。

【结果】

将MACS柱移出磁场外，用MACS柱洗脱液洗柱（较大流速），则该洗脱液中为CD4^-,CD8⁺或CD4⁺CD8⁺细胞（即阳性分离）。离心洗涤后调整细胞至所需浓度备用。为了进一步提高细胞分离纯度，可再用另外两个MACS柱重复上述过柱过程并用流式细胞仪进行分析测定。

【注意事项】

1. MACS柱用完毕后需立即用双蒸水冲洗干净，再以20倍于柱体积的无菌双蒸水和5倍于柱体积的95％乙醇溶液洗涤，37℃下烘干，高压灭菌以备再次使用。

2．不要将大团细胞加入柱内，以免造成堵塞进而毁坏MACS柱。

3．洗脱MACS柱时，流速越慢则分离细胞的纯度越高。在MACS柱上加入液体时不要产生气泡。

4．在分离洗脱时，柱内液体不要低于柱内的铁丝基质平面以下，即始终让铁丝基质内含有液体，否则细胞分离将完全失败。

5．如果分选的细胞还需要进行培养，所有的器材和液体均应无菌。MACS分离过程应在超净工作台内完成操作。

（二）用尼龙毛柱分离T细胞和B细胞

【材料】

尼龙毛柱的制备（注意无菌操作）：

1．取直径3D，长度约10cm的尼龙毛（聚酞胺纤维），用0.2mo1/L HCl浸泡过夜，用双蒸水洗净HCl，置37℃烘干备用。

2．称取50mg尼龙毛，均匀分散后置Hanks液中浸泡。取1 ml注射器，出口接塑料管并夹住，将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高5～6cm。此柱可分离约2x10⁷细胞。

【方法】

1．取PBMC，用含10％小牛血清的RPMI 164。培养液将细胞配成2x10⁷/0.5ml。

2．用5 ml预温至37℃的细胞培养液洗涤尼龙毛柱。将0.5 ml上述PBMC悬液加入尼龙毛柱中。待细胞悬液全部进入尼龙毛柱后，立即加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管。

3．在37℃,5% CO₂培养箱中培养1小时，使细胞与尼龙毛充分黏附，用5 ml预温至37℃的细胞培养液洗脱尼龙毛柱，洗脱液中含有纯的T细胞，1000r/min离心洗脱液10分钟，去上清液，再用细胞培养液洗涤细胞并计数，用细胞培养液将细胞配成适当浓度。用力反复挤压尼龙柱，挤出黏附在尼龙柱上的B细胞，并用少量的RPMI 1640培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B细胞。

【结果】

如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80%。

【注意事项】

1．基本上何时结束收集取决于流出液体中细胞的浓度，实际上，收集的量达到一个柱体积时就可以停止收集，因为即使收集更多的量，回收率几乎不会增加。

2．尼龙毛采用辐射灭菌。

（三）流式细胞仪分离T细胞和B细胞

【原理】

流式细胞仪（flow cytometry,FCM）主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个／秒），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管。本法分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行。

【材料】

1. RPMI 1640培养基应选购不含酚磺酞的，使用时加入5％的小牛血清。

2. FITC-抗CD3单克隆抗体FITC为异硫氰酸荧光素，CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）。

【方法】

1．用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI 1640培养基配成1x10⁷/ml。

2．加适量FITC-抗CD3,4℃孵育30分钟，用RPMI 1640培养基洗2次。

3．按操作手册规程进行流式细胞仪分析。

【结果】

用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。

【注意事项】

1．需要严格无菌操作。

2．由于喷嘴孔很小（70～100um)，分选前用30～40 um孔径的滤网过滤细胞悬液，以免稀薄凝块堵塞喷嘴。