北京普天同创生物科技有限公司
常用玻璃器皿吸附法(原理及方法同淋巴细胞的分离和纯化):用含5%小牛血清的PRMI-1640培养基将单个核细胞配成细胞悬液,将细胞悬液置于玻璃平皿内,37℃静置30~60分钟。单核细胞即吸附于平皿表面,吸去非吸附细胞(淋巴细胞),用尖吸管反复吹打吸附于玻璃表面的单核巨噬细胞,或用橡皮刮轻轻刮离,使黏附的单核细胞脱落,并收集配成细胞悬液,经非特异醋酶染色(单核细胞为阳性)证明其纯度,锥虫蓝拒染法计算存活率,其存活率应大于95%,4℃保存备用。
NK细胞的分离
【原理】
NK细胞即自然杀伤细胞(natural killer cell,NK ),是一群具有自然杀伤能力的大颗粒淋巴细胞。它们不需要抗原激活,也没有MHC限制性,能直接杀伤肿瘤细胞。成熟的NK细胞离开骨髓进入外周免疫器官,主要分布在脾脏和外周血中,约占外周血的3%,NK细胞没有黏附作用。在此介绍Percoll不连续密度梯度分离法分离NK细胞。
【材料】
1. pH 7.3枸橼酸缓冲液;
枸橼酸 327mg
枸橼酸钠 2.63g
碳酸氢钠 222mg
葡萄糖 2.55 mg
蒸馏水加到 100m1
2.聚蔗糖-泛影葡胺分层液(D=1.077±0.001);
3. Percoll ( Pharmacia)产品;
4. Hanks液(含5%小牛血清)。
【方法】
1.外周血单个核细胞的分离将外周血与枸橼酸缓冲液按7:1比例混合后离心,1000r/min,10分钟,弃上清液,注意勿触及细胞沉淀,用吸管小心吸取细胞沉淀上面富含白细胞的部分,以3倍体积的Hanks液稀释细胞,置于聚蔗糖-泛影葡胺分层液上,离心,2000r/min,20分钟,小心吸取界面白细胞部分,用Hanks液洗2次,配成(0.5~1)x108/ml。
2.非连续Percoll密度梯度离心
(1)将Percoll渗透压调整到285mOsmol/kg H20;
(2)制备7种不同的Percoll分层液,范围为40%~57.5%,每梯度相差2.5%,40%,42.5%,45%,47.5%,50%,52.5%,55%,57.5%;
(3)将不同梯度的Percoll轻轻地一层层铺起,从高密度至低密度,最后加l ml细胞悬液于顶部离心,2000r/min离心30分钟;
(4)小心地吸取第二、三部分的细胞。第一部分是顶部液体与40% Percoll之间,第二部分是40%与42.5 % Percoll之间,第三部分是42.5%与45%的Percoll之间,这两部分富含NK细胞;
(5)用Hanks液洗2次,1000r/min,10分钟,细胞重悬于Hanks液中。
【结果】
CD56, CD57单抗间接免疫荧光发鉴定纯度,锥虫蓝拒染法测存活率,4℃存放备用。
【注意事项】
1.实验宜在4℃下进行,以保持细胞活力。
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