光学显微镜是观察细胞形态和结构的重要工具，其种类很多，倒置显微镜和荧光显微镜的应用最为广泛。成像原理是：光线自反射镜射入聚光器，经聚光器集聚增强，照射在标本上。标本的像经物镜放大成像于目镜和物镜之间，形成倒像。目镜将此倒像进一步放大成像于人眼的视网膜上，形成正像。

一、利用倒置显微镜观察细胞的形态和结构

将培养瓶置于倒置显微镜下观察，可见到生长状态良好的细胞，透明度大，细胞内颗粒少，无空泡，胞膜清晰，培养上清液清澈透明，看不到悬浮的细胞和碎片；若细胞功能不良时，胞质中常出现空泡、脂滴和其他颗粒状物，细胞之间空隙加大，细胞形态可变得不规则甚至失去原有特点，只有状态良好的细胞才能用于实验。

（一）普通染色法观察

1．吉姆萨（Giemsa）染色法该染色法是最常用的方法之一，简便、快速，适用于多种细胞和染色体染色。

【材料】

(1) Giemsa染液：称取Giemsa粉0.5 g，甘油22m1，在研钵内先用少量甘油与Giemsa粉充分混合，研磨至无颗粒，再将剩余的甘油混在一起。56℃保温2小时后，加入33ml纯甲醇，混匀，即为Giemsa母液，保存于棕色瓶内。取9份pH 6.80～7.38的Sorensen缓冲液和1份Giemsa母液混合得到染色液。

(2）被检细胞：盖片培养法的盖片培养物、或细胞涂片。对于贴壁生长的细胞，一般使其生长于盖破片上，以便操作。在细胞固定前应先用Hanks液、PBS或生理盐水等清洗2～3次，以去除妨碍染色的血清等。对悬浮细胞作涂片之前，需先将细胞离心（1000r/min,10分钟）沉淀，弃上清液（留少量液体）后，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，自然或冷风吹干备用。

【方法】

以盖片培养法或涂片法为例：

(1)用甲醇固定细胞标本10分钟；或用1份醋酸、3份甲醇固定30分钟。

(2）将染色液充分覆盖材料面（注意不要有泡沫，或在染色缸内染色亦可）。

(3)染色10～15分钟后。用清水充分冲洗玻片上的染液，空气干燥。

(4）二甲苯透明，用光学树脂封片后观察。

【结果】

细胞核染成紫红色或蓝紫色，胞质染成粉红色。

【注意事项】

（1)染色液宜现用现配，保存时间最好不超过48小时。

(2) Giemsa对pH极敏感，缓冲液pH要准确（Sorensen缓冲液的pH为6.80～7.38)。

2．苏木精一伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色HE染色法是采用碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生作用，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，该法能提供良好的胞核与胞质对比染色。HE染色的培养细胞样品制备有其特点，贴壁生长的细胞常用盖玻片培养法制备，悬浮生长的细胞可用离心甩片机制备。

【材料】

(1）苏木精染液（20x)：称取苏木精0.5g,铵矾或钾明矾5.Og、碘酸钠（NaI0₃) 0.1g，将其加热溶于70m1蒸馏水中，再加入甘油30m1，冰醋酸2m1,混匀。过滤后即成（20x)母液，可长期保存。使用时，用蒸馏水按1:20比例稀释成工作液。

(2）伊红染液：伊红有醇溶性和水溶性两种染液。将lg伊红溶于100m1 70％乙醇或100m1蒸馏水中即得1％的伊红染液。

(3）染色辅助液：10％甲醛,0.5盐酸-70％乙醇,1% NaHC0₃，梯度浓度70%,80%,90%,95%,100％乙醇，二甲苯与光学树脂等。

(4)被检细胞：贴壁细胞常用盖玻片培养法的盖片培养物，悬浮细胞可用离心甩片机制备。

【方法】

以盖片培养法为例：

(1)固定细胞：盖玻片培养物用37℃温PBS漂洗3次后，用10％甲醛固定30分钟，或用丙酮固定15分钟。

(2）细胞核染色：蒸馏水漂洗1次后，用苏木精染液染色（细胞核）10分钟。加入0.5％盐酸-70％乙醇30秒～1分钟进行分色，以脱去胞质的着色。此时胞核呈紫红色，然后置入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝紫色。如果时间较充分，最好用自来水（呈弱碱性）长时间浸泡。也可置入1 % NaHCO₃中漂洗，此过程需不断地用显微镜观察，以掌握碱化时间。

(3）蒸馏水洗1分钟，充分去除残留的碱性溶液，否则会影响伊红染色。

(4）胞质染色：1％伊红染液中染色30秒～1分钟。

(5）梯度乙醇溶液脱水：先用蒸馏水洗去玻片上的浮色，然后依次用70%,80%,90%乙醇脱水1次，再经95%,100％乙醇脱水2次，每次1分钟。如伊红为乙醇溶液，可略去70％乙醇梯度。

(6)浸入二甲苯中透明2次，各5分钟，光学树脂封片后观察。

【结果】

细胞经HE染色后，光镜下细胞核呈紫蓝色或深蓝色，胞质染成粉红色。