在培养细胞的消化分离、传代、冻存和复苏等过程中，均可导致细胞死亡。在培养中可通过常规观察了解培养细胞的生长状况，也可通过一些试验检查细胞的活性。

（一）培养细胞的常规观察

一般在细胞接种或传代后，每天或至多间隔1～2天，应观察细胞的形态、生长、培养液pH和污染与否等，随时掌握细胞的动态变化，以便做换液或传代处理。如发现异常情况，及时采取措施。

细胞生长过程中，CO₂积累增多，由于培养基内含有pH指示剂，因此其颜色的变化可间接反映细胞的生长状态。正常情况下培养液呈桃红色；呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色则可能是培养时间过长，营养不足，细胞死亡过多；呈紫红色则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。若发现有的培养瓶内出现培养液浑浊，要及时挑出来结束培养，否则可能将培养细胞的污染向周围扩散。

（二）培养细胞的活力检测

细胞活力对判断细胞培养的成功与否具有重要作用。检查细胞活性通常使用染色拒斥法、MTT比色法、中性红试验和荧光素双乙酸盐试验等（表2-1)。

1．锥虫蓝（Trypan blue，音译为台盼蓝，即商品名）拒染法

【材料】

(1)待测活力的细胞（贴壁细胞或悬浮细胞）；

(2）培养及消化用液：待测细胞的培养液、Hanks液，0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合消化液；

(3) 0.4％锥虫蓝（用PBS配制），载玻片和盖玻片等。

【方法】

(1)待测细胞是贴壁细胞，倒掉培养液，加入消化液，在37℃条件下消化1～2分钟。然后吸出消化液，加入一定量的培养液，吹打并制成细胞悬液；如果是悬浮培养细胞，可直接用于检测细胞活力。

(2）取0. 2m1待测细胞悬液，加入0.5 ml 0.4％锥虫蓝溶液和0.3 ml Hanks液，充分混匀，立即取上述细胞悬液少许滴于载玻片上，覆以盖玻片，用低倍镜至少计数200个细胞和其中蓝染的细胞。按下列公式计算细胞存活率。

细胞存活率（％）=（总细胞数-蓝染细胞数）／总细胞数×100%

【结果】

正常细胞不着色，死细胞因细胞膜通透性增大，锥虫蓝进入细胞内使其染成蓝色。细胞存活率在90％以上比较好，细胞分装后进行培养的成功率大，存活率在70％以下的细胞，培养成功的机会不大。

【注意事项】

(1)测试细胞活力的锥虫蓝染液对细胞膜有一定的影响，如果含有锥虫蓝的细胞悬液放置时间过长，正常细胞也可摄取染料，影响细胞活力测试结果的准确性，故在细胞悬液中加入锥虫蓝后，要抓紧时间进行细胞计数，整个过程不应超过10分钟。

(2）锥虫蓝法虽然简便快速，但对检测细胞活力却是一种较粗略的方法，它不能准确地反映细胞代谢活性的差异。

2. MTT比色法 四氮唑盐［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl Tertrazolium bro-mide, MTT]比色法能较准确地反映细胞的存活状态，较为常用。MTT在不含酚磺酞的培养液中溶解后呈黄色，活细胞线粒体在三羧酸循环中，琥珀酸脱氢酶能催化琥珀酸脱氢，MTT可接受脱下来的氢离子，使可溶性的黄色MTT溶液还原为紫蓝色、不可溶性的甲臜(formazan）颗粒，并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。再用二甲基亚砜(DMSO )或酸性异丙醇可溶解紫蓝色的甲臜颗粒，在酶标仪下测定其光吸收值，即可计算出存活细胞数。该法除用于细胞活力检测外，还被用于细胞毒性实验和抗肿瘤药物的筛选等。

【材料】

(1)待测细胞：培养的贴壁细胞或悬浮细胞；

(2) MTT溶液：用不含酚磺酞的培养液或用0.0l mol/L PBS (pH 7.2～7.4）配成5mg/ml的MTT，在磁力搅拌器上搅拌30分钟，再用0.22um微孔滤器过滤除菌。该液要现用现配或配好后避光4℃储存备用一周。

（3）溶解剂：酸性异丙醇溶液是用0.04～0.lmol/L盐酸配制。

(4）其他用具：振荡混合仪、无菌的96孔板、加样枪及枪头、酶标仪等。

【方法】

(1)在培养皿中按培养液量的10％加入MTT溶液，于37℃下继续培养4小时。

(2）吸去培养液，加入与培养液等量的DMSO或酸性异丙醇；对于悬浮生长的细胞需离心（1000r/min,5分钟），小心吸弃培养液，再加入与培养液等量的DMSO或酸性异丙醇。在振荡混合仪上振荡10分钟，使结晶充分溶解，即使紫蓝色沉淀充分溶解。

(3）用酶标仪在波长490nm下检测，参考波长450～600nm。以只加培养液的培养皿为空白对照组，计算细胞存活率。公式如下：

细胞存活率（％）=试验组光吸收值／对照组光吸收值×100%

【结果】

活细胞在三羧酸循环中能催化琥珀酸脱氢，MTT（黄色可溶性液体）接受氢离子还原为甲臜( formazan )颗粒（液体中含有紫蓝色不可溶性颗粒），DMSO或酸性异丙醇可溶解紫蓝色的甲臜颗粒，使MTT从黄色变为紫蓝色；而死细胞则无此功能，MTT仍保持原先的黄色。在酶标仪下测定MTT和细胞培养液反应后的颜色变化，即可指示培养液中细胞的存活率。

【注意事项】

(1)高浓度血清会影响光吸收值，培养液中常使用10% FBS，在加入DMSO或酸性异丙醇之前应尽量吸净培养液。

(2）吸去培养液时，动作要慢，以免吸去甲臜颗粒。

(3)接种细胞量要适宜，这样才能保证MTT沉淀形成的量与细胞数量呈良好的线性关系。细胞过少容易造成细胞接种不匀，引起较大的实验误差。