1) 放置平衡的IPG胶条：将平衡后的IPG胶条在SDS电泳缓冲液中蘸一下，来润滑IPG胶条。将IPG胶条放在位于玻璃板之间的凝胶面上，使胶条塑料支持膜贴着其中一块玻璃板，整个胶条下部边缘与板胶的上表面完全接触。确保在IPG胶条与板胶之间以及玻璃板与塑料支持膜间无气泡产生。

2）加入分子量标准蛋白：分子量标准蛋白溶液与等体积的1％琼脂糖溶液混合后，加入到等电聚焦上样滤纸片上能得到很好的效果。终浓度为0.5％的琼脂糖会凝聚，在加电压前可以防止标准蛋白的扩散。其他可选的方法是，将标准蛋白以15-20μl的体积加入到等电聚焦上样滤纸片上，如要减少加样量，可将上样滤纸片切成更小的面积。上样滤纸片放在玻璃板上，将一定量的蛋白标准溶液加到上样滤纸片上。然后用镊子将上样滤纸片放置在IPG胶条末端一侧的凝胶表面。进行考马斯亮蓝染色的标准溶液的各种蛋白成分必须达到0.2-1.0μg;而进行银染色必须在10-50ng之间。

3) IPG胶条的固定：用熔化的琼脂糖封顶液将IPG胶条密封在凝胶顶部，以防止上部缓冲液漏液，避免IPG胶条在电泳缓冲液中滑动。在此过程中，不要产生气泡。使用最低量的密封液使IPG胶条完全覆盖住，密封液完全固化大约需要1 min，随即可进行电泳。