平衡步骤是将IPG胶条浸没在进行第二向分离所必需的SDS缓冲体系中。平衡液包含：缓冲液、尿素、甘油、还原剂、SDS和染料。可选用碘乙酰胺来代替还原剂。在第二向电泳前进行平衡，平衡后不要在-40℃或更低的温度保存。

（1) 平衡液成分

1) 50 mmol/L Tris·HC1 (pH8. 8 )，使IPG胶条pH维持在适合电泳的范围内。

2) 6mo1/L尿素（Urea)：与甘油一起通过增加缓冲溶液的粘滞性，来减小电内渗效应。电内渗是由于电场在IPG胶条上存在固定电荷，干扰了蛋白质从IPG胶条向第二向凝胶移动。

3) 30％甘油（glycorol)：与尿素一起减少电内渗，并且促进蛋白质由IPG胶条向第二向凝胶移动。

4) DTT：使变性的非烷基化的蛋白质处于还原状态。

5) SDS：使蛋白质变性并且形成带负电的蛋白质-SDS复合物。与蛋白质结合的SDS数量以及由此而产生额外的负电荷直接与蛋白质的质量成比例。因此，蛋白质电泳使蛋白质通过含有SDS的胶筛，依靠蛋白质的分子量将蛋白分离。

6) 碘乙酰胺：使蛋白质巯基烷基化，防止它们在电泳过程中重新氧化。在电泳过程中蛋白的氧化会产生拖尾和其他结果。碘乙酰胺还可以使残留的DTT烷基化，从而防止产生点拖尾和其他银染杂质。碘乙用碘乙酰胺进行平衡也可以减少不希望的半胱胺酸残留物的反应。

7) 溴酚蓝（tracking dye)：用来指示电泳程度。

(2）平衡步骤在进行IPG胶条平衡前，第二向凝胶必须准备好。

1) 配置平衡液：见附录，这是一种储备的溶液，使用前在l0mlSDS平衡缓冲液中加入100mg DTT。

2）第一步平衡：IPG胶条分别放入试管内，支持膜贴着管壁。加入l0ml含有DTT的平衡液。用盖子盖住试管或用封口膜封住试管，将其平放在摇床上，平衡巧分钟。

3）第二步平衡：利用含碘乙酰胺的平衡溶液（不含DDT)进行第二步平衡，每10m1 SDS平衡缓冲液中加入250mg碘乙酰胺。当利用平板电泳仪进行第二向分离时，第二步平衡能减少点拖尾和其他干扰。加入l0ml含有碘酰胺的平衡液到各试管。用盖子盖住试管或用封口膜封住试管，将其平放在摇床上，平衡15分钟。