当细胞被破碎后，蛋白水解酶被释放出来并且被激活。在蛋白质变性过程中发生的蛋白水解，会使双向电泳的最后结果复杂化，因此，必须采用一些方法来避免这些问题的发生。如果可能，直接将样品在高浓度的变性液中变性，如用8mol/L尿素、10% TCA（三氯乙酸）或2%SDS来抑制蛋白酶。在低温状态下，蛋白酶的活性较低，因此，建议样品制备尽可能地在低温条件下进行。此外，许多蛋白酶在pH 9. 0以上可以失活，因此，在Tris碱、碳酸钠或碱性载体两性电解质存在的条件下，往往能抑制蛋白水解。

单独使用上述方法来抑制部分蛋白的水解已经足够了。然而，有些蛋白酶在这些条件下仍然保持着活性。因此，要保证蛋白样品的质量，最好还要适当地使用蛋白酶抑制剂。每一种蛋白酶抑制剂只对某一类蛋白酶起作用，建议复合使用蛋白酶抑制剂。

PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride，苯甲基磺酞酰氟）：能抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶的水解作用，使用浓度为1 mmol/L，为不可逆抑制剂。PMSF在含水溶液中很快失活，需在使用前新鲜配制。PMSF在含有琉基试剂（DTT或2-巯基乙醇）时效果不好。这种缺点可以通过先将样品重悬在含有PMSF而无巯基去污剂的溶液中克服，含巯基去污剂可以在其后加入。PMSF的毒性相当大。

AEBSF (aminoethyl benzylsulfonyl fluoride或Pefabloc SC )：为丝氨酸蛋白酶抑制剂，使用浓度为4 mmol/L。AEBSF在抑制活性上与PMSF相近，但它更易溶于水而且毒性低。AEBSF具有修饰能力，会改变蛋白的pl。

EDTA和EGTA：使用浓度为1 mmol/L，通过鳌合蛋白酶维持活性所必需的金属离子，来抑制金属蛋白酶活性。

多肽蛋白酶抑制剂：如leupeptin、pepstatin、aprotinin和bestatin,为不可逆抑制剂，在DTT存在下起作用，使用浓度2-20μg/ml。亮肽素（leupeptin）能抑制多种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶；抑肽素（pepstatin )抑制天冬氨酸蛋白酶；抑肽酶(aprotinin )能抑制许多丝氨酸蛋白酶；苯丁抑制剂（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶。多肽蛋白酶抑制剂是小分子多肽，因此，有可能出现在双向电泳结果中；根据其分子大小范围可被第二向凝胶分离。抑肽素（pepstatin )在pH为9时不能起抑制作用。

TLCK和TPCK（对甲苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮、苯磺酰基赖氨酸氯甲基酮）：使用浓度0. 1 -0.5mmo1/L，不可逆地抑制丝氨酸和半胱氨酸水解的蛋白酶。

苄眯( benzamidine )：丝氨酸蛋白酶抑制剂，使用浓度13 mmol/L。