一、原理

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外线照射下，噻嘧色素发出荧光。在给定的条件下，以及没有其他荧光物质干扰时，此荧光之强度与噻嘧色素量成正比，即与溶液中硫胺素量成正比。如试样中含杂质过多，应经过离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后以所得溶液作测定。

二、试剂

(1)正丁醇：需经重蒸馏后使用。

(2）无水硫酸钠。

(3)淀粉酶和蛋白酶。

(4)0.1mol/L盐酸：8.5mL浓盐酸（相对密度1.19或1.20)用水稀释至1000mL。

(5)0.3mol/L盐酸：25.5mL浓盐酸用水稀释至1000mL。

(6)2mol/L乙酸钠溶液：164g无水乙酸钠溶于水中稀释至1000mL。

(7)氯化钾溶液（250g/L):250g氯化钾溶于水中稀释至1000mL。

(8)酸性氯化钾溶液（250g/L):8.5mL浓盐酸用25%氯化钾溶液稀释至1000mL。

(9)氢氧化钠溶液（150g/L):15g氢氧化钠溶于水中稀释至100mL。

(10)1％铁氰化钾溶液（10g/L):lg铁氰化钾溶于水中稀释至100mL，放于棕色瓶内保存。

(11)碱性铁氰化钾溶液：取4mL10g/L铁氰化钾溶液，用150g/L氢氧化钠溶液稀释至60mL。用时现配，避光使用。

(12）乙酸溶液：30mL冰乙酸用水稀释至1000mL。

(13）活性人造浮石：称取200g40-60目的人造浮石，以10倍于其容积的热乙酸溶液搅洗2次，每次10min；再用5倍于其容积的250g/L热氯化钾溶液搅洗15min；然后再用稀乙酸溶液搅洗10min；最后用热蒸馏水洗至没有氯离子。于蒸馏水中保存。

（14）硫胺素标准储备液（0.1mg/mL)：准确称取100mg经氯化钙干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L盐酸中，并稀释至1000mL。于冰箱中避光保存。

(15）硫胺素标准中间液（10μg/mL)：将硫胺素标准储备液用0.01mol/L盐酸稀释10倍，于冰箱中避光保存。

(16)硫胺素标准使用液（0.1μg/mL)：将硫胺素标准中间液用水稀释100倍，用时现配。

(17)溴甲酚绿溶液（0.4g/L)：称取0.1g溴甲酚绿，置于小研钵中，加入1.4mL0.1mol/L氢氧化钠溶液研磨片刻，再加入少许水继续研磨至完全溶解，用水稀释至250mL。

三、仪器

（1)电热恒温培养箱。

(2)荧光分光光度计。

(3)Maizel一Gerson反应瓶。

(4)盐基交换管。

四、分析步骤

4.1试样制备

4.1.1试样准备

试样采集后用匀浆机打成匀浆于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后混匀使用。干燥试样要将其尽量粉碎后备用。

4.1.2提取

(1)准确称取一定量试样（估计其硫胺素含量约为10一30μg，一般称取2－10g试样），置于100mL三角瓶中，加入50mL0.1mol/L或0.3mol/L盐酸使其溶解，放入高压锅中加热水解，121℃30min，凉后取出。

(2）用2mol/L乙酸钠调其pH值为4.5（以0.4g/L溴甲酚绿为外指示剂）。

(3)按每克试样加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45一50℃温箱过夜保温（约16h)。

(4)凉至室温，定容至100mL，然后混匀过滤，即为提取液。

4.1.3净化

(1)用少许脱脂棉铺于盐基交换管的交换柱底部，加水将棉纤维中气泡排出，再加约1g活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度。保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。

(2)用移液管加入提取液20一60mL（使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2一5μg)。

(3）加入约10mL热蒸馏水冲洗交换柱，弃去洗液。如此重复3次。

(4）加入20mL250g/L酸性氯化钾（温度为90℃左右），收集此液于25mL刻度试管内，凉至室温，用250g/L酸性氯化钾定容至25mL，即为试样净化液。

(5)重复上述操作，将20mL硫胺素标准使用液加入盐基交换管以代替试样提取液，即得到标准净化液。

4.1.4氧化

(1)将5mL试样净化液分别加入A、B两个反应瓶。

(2)在避光条件下将3mL150g/L氢氧化钠加入反应瓶A，将3mL碱性铁氰化钾溶液加入反应瓶B，振摇约15s，然后加入10mL正丁醇；将A,B两个反应瓶同时用力振摇1.5min。

(3）重复上述操作，用标准净化液代替试样净化液。

(4)静置分层后吸去下层碱性溶液，加入2一3g无水硫酸钠使溶液脱水。

4.2测定

（1)荧光测定条件：激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。

(2）依次测定下列荧光强度：

①试样空白荧光强度（试样反应瓶A);

②标准空白荧光强度（标准反应瓶A);

③试样荧光强度（试样反应瓶B)；

④标准荧光强度（标准反应瓶B)。

五、结果计算

X=(U-Ub)×(c·V)/(S-Sb)×V1/V2×1/m×100/1000

式中:X一试样中硫胺素含量，mg/100g;

U－试样荧光强度；

Ub—试样空白荧光强度；

S—标准荧光强度；

Sb—标准空白荧光强度；

c—硫胺素标准使用液浓度，μg/mL;

V一用于净化的硫胺素标准使用液体积，mL;

V1—试样水解后定容之体积，mL;

V2—试样用于净化的提取液体积，mL;

m—试样质量，g；

100/1000—试样含量由微克每（μg/g)换算成毫克每百克（mg/100g)的系数。

计算结果保留两位有效数字

六、精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

七、说明及注意事项

(1)本标准适用于各类食品中硫胺素的测定

(2）本方法检出限为0.05μg，线性范围为0.2~10μg。