一、原理

去除试样中的脂肪和蛋白质，甲醇稀释，过滤后，采用反相液相色谱法分离测定。

二、试剂和材料

除非另有规定，本方法所使用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。

（1）甲醇（CH3OH)：色谱纯。

(2）亚铁氰化钾溶液（92g/L)：称取亚铁氰化钾［K4Fe(CN)6·3H2O]106g,用水溶解于1000mL容量瓶中，定容到刻度后混匀。

(3）乙酸锌溶液（183g/L)：称取乙酸锌［Zn(CH3COO)2·2H2O]219g，加入32mL乙酸，用水溶解于1000mL容量瓶中，定容到刻度后混匀。

(4）磷酸盐缓冲液（pH=6.7)：分别称取2.5g磷酸二氢钾（KH2POa）和2.5g磷酸氢二钾（K2HPO4.3H2O）于1000mL容量瓶中，用水定容到刻度后混匀，用滤膜（9)过滤后备用。

(5)氢氧化钠溶液（0.1mol/L)：称量4g氢氧化钠（NaOH)，用水溶解于1000mL容量瓶中，定容到刻度后混匀。

(6）硫酸溶液（0.5mol/L)：移取30mL的浓硫酸（H2SO4）到500mL水中，边搅拌边缓慢加入，冷却到室温后转移到1000mL容量瓶，定容到刻度后混匀。

(7）甲醇水溶液：体积分数为50％。

（8）标准溶液

①苯甲酸和山梨酸标准储备液：每毫升含苯甲酸、山梨酸各500μg。

准确称取苯甲酸、山梨酸标准品各50.0mg，分别置于100mL容量瓶中，用甲醇(1)溶解，并稀释至刻度。摇匀后，冷藏于冰箱中，有效期2个月。

②苯甲酸和山梨酸的混合标准工作液：每毫升含苯甲酸、山梨酸各10μg。

分别吸取苯甲酸和山梨酸的标准储备液（①）各5mL，至250mL的容量瓶中，用甲醇水溶液（7)定容至刻度后混匀。冷藏于冰箱中，有效期5d。

(9)滤膜：0.45μm

三、仪器和设备

（1)高效液相色谱仪，配有紫外检测器。

(2）天平：感量为0.1mg,0.01g。

四、分析步骤

4.1试样制备

4.1.1液态试样

储藏在冰箱中的乳与乳制品，应在试验前预先取出，并达室温，称量20g（精确至0.01g）样品于100mL容量瓶中。

4.1.2固态试样

称量3g（精确至0.0lg）样品于100mL容量瓶中，加10mL水，用玻璃棒搅拌至完全溶解。

4.2萃取和净化

向盛有试样（8.4.1.1)的容量瓶中加入25mL氢氧化钠溶液，混合后置于超声波水浴或70℃水浴中处理15min。冷却后，用硫酸溶液将pH调节到8(用pH计或pH试纸均可），然后加入2mL亚铁氰化钾溶液和2mL乙酸锌溶液。剧烈振摇，静置巧min,混合后冷却到室温，再用甲醇定容，静置15min，上清液经过滤膜过滤。收集滤液作为试样溶液，用于高效液相色谱仪测定。

4.3色谱参考条件

色谱柱：C18，250mm×4.6mm,5μm。

流动相：甲醇一磷酸盐缓冲溶液＝1+9。

流速：1.2mL/min。

检测波长：227nm。

柱温：室温。

进样量：10μL。

4.4测定

准确吸取各不少于2份的10μL试样溶液（(8.4.1.2）和苯甲酸和山梨酸的混合标准工作液，以色谱峰面积定量。在上述色谱条件下，出峰顺序依次为苯甲酸、山梨酸。

五、分析结果的表述

试样中苯甲酸、山梨酸的含量按下式进行计算：

X=(A×cs×V)/As×m

式中：X—试样中苯甲酸、山梨酸含量，mg/kg;

A—试样溶液中苯甲酸、山梨酸的峰面积；

As—标准溶液中苯甲酸、山梨酸的峰面积；

cs—标准溶液的浓度，μg/mL;

V—试样最终定容体积，mL;

m—取样质量，g。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

六、精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

七、说明及注意事项

(1)本标准适用于乳与乳制品中苯甲酸和山梨酸含量的测定。

(2）本方法苯甲酸、山梨酸的检出限均为1mg/kg.