1)液液萃取(liquid liquid extraction， LLE)

动物基质中CAPs的检测，其提取溶剂分为有机溶剂和水溶液两类。

A.有机溶剂提取

常用的有机溶剂有乙酸乙酯、乙腈、甲醇和丙酮等，也可以进行不同比例混合后提取。提取溶剂中常加入无水硫酸钠、氯化钠等，除去样品中水分的同时，盐析蛋白质，提高提取效率。乙酸乙酯既能有效提取CAPs，又能减少蛋白质等水溶性杂质被萃取到溶剂中，是采用最多的提取溶剂。

Rodziewicz等建立了奶粉中CAP的残留分析方法。用乙酸乙酯采取LLE方法提取，脂肪用正己烷除去，LC-MS/MS测定。方法回收率为90.2%～96.3%，日内RSD小于12%，日间RSD小于15%；CCa为0.09ug/kg，CCβ为011ug/kg、Xia等用乙酸乙酯提取鸡肝、猪肝中CAP，正已烷除脂后，Oasis HLB固相萃取柱净化，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测。方法回收率为95.5%～106.7%，RSD小于12.2%，方法LOD小于0.02ug/kg。Chou等用乙酸乙酯提取猪肉、猪肝、猪肾、牛肉、牛肝、鱼和鸡肉中的TAP和FF，正己烷除脂后，LC-MS/MS检测。方法回收率为72.5%～97.6%，定量限(LOQ)均为1.0ng/g。蒋定国等用含有1%高氯酸的乙酸乙酯提取牛奶中的CAP，提取液浓缩干后用0.5mol/L高氯酸溶液溶解，正己烷去除脂溶性杂质，高效液相色谱(HPLC)测定。高氯酸可以很好的去除蛋白。方法LOD为11ug/kg，平均回收率为88.0%～97.7%，RSD为5.3%～6.4%。

Wang等以建立了牛奶中CAP的快速分析方法。用乙腈提取后，LC-MS/MS测定。方法LOD为0.05ug/kg，LOQ为0.2ug/kg；回收率在88.8%～100.6%之间，RSD小于15%。Tian采用乙腈提取牛奶中包括CAP在内的29种药物，C18固相萃取柱净化后，采用LC-MS/MS检测。方法回收率为71%～107%，RSD小于13.7%；CAP的LOQ为0.03ug/kg、Lu等用乙腈提取鸡蛋、牛奶、蜂蜜中的CAP，固相萃取柱净化后，LC-MS/MS检测。平均回收率在95.8%～102.3%之间，日内和日间RSD分别小于7.13%和8.89%。Cronly等开发了牛奶和蜂蜜中CAP的检测方法。牛奶中加入NaCI后直接用乙腈提取，蜂蜜先加水稀释后，再用乙腈提取，提取液用正己烷除脂，LC-MS/MS测定。牛奶中的CCa和CCβ分别为0.07ug/L和0.11ug/L，蜂蜜中分别为0.08μg/kg和0.13μg/kg。

Vargas Mamani等采用甲醇提取牛奶中的CAP等药物，经固相萃取净化后，HPLC测定。方法回收率和灵敏度均满足残留分析要求。

van de Riet等采用丙酮提取水产品中的CAP、TAP、FF和FFa，提取液再用二氯甲烷反萃取，蒸干后，用稀酸溶解，正己烷除脂，液相色谱-质谱(LC-MS)测定。方法回收率在71%～107%之间，RSD小于10%；CAP和FF的CCa为0.1ng/g，TAP为0.3ng/g，FFa为1.0ng/g。

大部分CAPs是中等极性化合物，在乙酸乙酯、乙腈等有机溶剂中均有较高的溶解度，但FF代谢物—FFa分子中含有碱性的氨基，常在碱性条件下提取。Xie等建立了鸡蛋中TAP、FF、FFa的HPLC分析方法。样品用乙酸乙酯-乙腈-氨水(49+49+2，v/v)提取，正己烷除脂后，HPLC-荧光检测器(FLD)测定。方法LOD为1.5ugkg(TAP、FF)，0.5ug/kg(FFa)，LOQ为5ug/kg(TAP、FF)，2ug/kg(FFa)：回收率为86.4%～93.8% (TAP)、87.4%～92.3%(FF)、89.0%～95.2%(FFa)，日内和日间RSD分别小于6.7%和10.8%。Zhang等用2%氨水-乙酸乙酯提取鸡肉中CAP、TAP、FF、FFa，蒸干提取液后，5%乙酸水溶液复溶，正己烷脱脂，MCX固相萃取柱净化，LC-MS/MS检测。方法LOD：CAP为0.1ug/kg，TAP、FFa为1ug/kg，FF为0.2ug/kg，回收率在95.1%～107.3%之间，日内和日间RSD分别小于10.9%和10.6%。彭涛等用LC-MS/MS同时测定虾中的CAP、TAP和FF。均质后的样品采用碱化乙酸乙酯提取，浓缩提取物经去除脂肪、C₁₈固相萃取柱净化后，采用LC-MS/MS检测。方法LOD为：CAP和FFO.01ng/g，TAP 0.05ng/g；在添加浓度0.1～2.0ng/g范围内，CAP回收率为73.9%～96.0%，TAP为78.6%～99.5%，FF为74.9%～103.7%，RSD均小于6.4%。

B.水溶液提取

纯水可以用来提取动物基质中的CAPs。Aerts等报道了多个实验室检测CAP的协同研究。动物肌肉经匀浆后加适量水提取后，再过C₈或C₁₈固相萃取柱净化，HPLC-紫外检测器(UVD)在278nm检测。方法LOD为1.5ug/kg；在添加浓度为10ug/kg时，不同实验室的平均回收率为55.1%，变异系数(CV)为18.0%，满足不同实验室分析CAP残留的要求。但该法回收率不高，可能是水不适合于提取组织里的CAPs药物。Fernandez-Torres等在水中采用酶探针结合超声波辅助提取(UAE)鱼肉和蚌中包括CAP、TAP在内的11种抗生素及其5种代谢物。对影响提取效率的因素，如酶种类、提取溶剂的种类、超声波的强度与时间等进行了优化，当用5mL水提取，超生5min时，效果最佳。提取物用二氯甲烷净化后，HPLC测定。方法技术指标满足残留分析要求。该研究小组又开发了酶探针结合微波辅助提取(MAE)鱼肉和蚌中包括CAP、TAP在内的11种抗生素及其5种代谢物的方法。当用5mL水，50W微波提取5min时，效果最佳。提取物用二氯甲烷净化后，LC-MS测定。方法回收率在70%～100%之间。

也有采用磷酸、磷酸盐缓冲液、醋酸缓冲液、Mcllvaine缓冲液等来提取CAPs。Rocha Siqueira等用磷酸提取鸡蛋、虾、鱼、鸡、猪、牛肉中的CAP，再用乙酸乙酯反萃取，LC-MS/MS检测。方法回收率在85%～120%之间，RSD小于20%，LOQ为0.1ug/kg。Santos等用pH 6.00.1 mol/L的磷酸缓冲液提取虹鳟鱼中的CAP，离心后，用正已烷除脂，乙酸乙酯反萃取，蒸干提取液后，用水复溶，C₁₈柱净化，LC-MS/MS测定，方法CCa为0.267ug/kg。 Ramos等用pH7.0的磷酸缓冲液提取虾组织中的CAP，C18固相萃取柱净化，LC-MS测定。方法回收率为101%～110%，日间CV小于7.1%；CCa为0.02ng/g，LOQ为0.2ng/g。谢孟峡等对鸡肉、猪肉、猪肝、鸭肝等动物组织样品中的CAP残留检测方法进行了研究。用乙酸乙酯和磷酸盐缓冲溶液提取，用硅胶和C₁₈固相萃取柱净化，经衍生化后用气相色谱-质谱(GC-MS)测定。该方法的加标回收率在80%～100%之间，RSD小于20%，方法LOD为0.1ug/kg

Verzegnassi等采用醋酸缓冲液稀释蜂蜜样品，经固相萃取净化后，LC-MS/MS测定。在0.1ug/kg、0.2ug/kg、0.5ug/kg添加水平，CAP的准确度优于15%，重复性和重现性分别为12%和18%；CCa和CCβ均优于0.1ug/kg。Wang等用 Mellvaine缓冲液-甲醇(8+2，v/v)提取牛奶中的CAP、TAP等10种抗生素，固相萃取柱净化后，UPLC测定。在0.1ug/g、0.5ug/g、2.5ug/g添加水平，方法回收率分别为52.1%～68.0%、70.1%～81.0%和76.2%～101.0%，LOD和LOQ分别在0.003～0.022ug/g和0.01～0.08ug/g之间。

也有采用三氯乙酸(TCA)溶液等提取，可以沉淀蛋白，提高回收率。Han等测定牛奶中CAP时，在牛奶中加入15% TCA沉淀蛋白，震荡离心，过0.45um滤膜，HPLC-UVD检测。方法回收率为97.1%～101.9%，RSD为1.1%～2.2%。

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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