(5)免疫分析技术(immunoanalysis)

1)酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

ELISA具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速的特点，有利于对大批量样品进行快速筛选检测。

Haasnoot等引将磺胺噻唑衍生物连接到小牛血清蛋白(BSA)上，免疫小鼠，制备出针对SAs通用结构的单克隆抗体。通过优化单克隆抗体27G3的间接竞争ELISA(ciELISA)方案，8种结构不同的SAs的IC₅₀均小于100ng/mL或5ng/孔。该研究小组又采用类似技术将SAs的芳氨基与BSA、匙孔血蓝蛋白(KLH)和辣根过氧化物酶(HRP)偶联，制备了8种不同SAs的多克隆抗体。利用这些抗血清和辣根过氧化物酶结合物开发的直接竞争ELISA试剂盒(cdELISAs)表现出较高的敏感性(IC₅₀为0.2～8.0ng/mL)和高特异性，并于之前制备的单克隆抗体进行了比较。李君华等采用重氮化法合成免疫抗原，通过免疫BALB/c小鼠进行融合，获得高特异、高灵敏度的单克隆抗体。在建立碳胺二甲嘧啶单克隆抗体杂交瘤细胞株和阻断ELISA的基础上，研制出一种一步法检测磺胺二甲嘧啶的ELISA快速检测试剂盒。结果表明，该试剂盒检测范围为0.5～40.5ug/L，检测时间为30min，IC₅₀为1.4ug/L，LOD达0.1ug/L。经大量现场试验，猪肉组织的LOD为1ug/kg，猪饲料为1ug/kg，猪尿为1.8ugL，牛奶为1.5ug/L，测试的平均回收率在70%～110%之间。Zhou等1以一种新型半抗原和单克隆抗体为基础，建立了ciELISA试验方法，用来检测食用动物组织中的SAs残留。以这种新型半抗原和载体分子偶联作为抗原免疫小鼠，免疫后的小鼠牌脏细胞可产生针对SAs的特异性抗体。所获得的单克隆抗体4E5对16种不同结构的SAs具有交叉反应。利用得到的单克隆抗体，建立并优化了ciELISA方法，该方法仅利用磷酸盐缓冲液就可快速提取、检测组织中的磺胺类药物。利用该方法对鸡肉中磺胺类药物进行检测，可检出范围为1.5～22.3ug/kg，回收率为70.6%～121%，RSD小于24.1%。

2)胶体金免疫层析法(immune colloidal gold technique，GICT)

胶体金免疫层析是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuClk)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合。胶体金免疫层析法因其快速、简便、灵敏度高的优点成为近几年用于牛奶、鸡蛋中残留检测的新方法。

Verheijen等由抗SD的多克隆抗体制备了胶体金试纸条，并建立了一步测试免疫分析方法。测试中的捕获试剂是被固定在该试纸条横向流动膜的SD-卵清蛋白(OVA)偶联物。在测试过程中，150uL的液体样品(缓冲液、尿液或牛奶)被加入试纸条的样品孔，在膜上迁移。样品里的分析物越多，与膜上固定的SD竞争结合检测试剂中有限抗体的效率就越高。样品中足够量的SD将阻止检测试剂中抗体与固定在膜上SD的结合。因此，阳性样本在读出区域将不显示测试线。应用该试纸条测试牛尿中SD的LOD为10ng/mL，牛奶为20ng/mL。该试纸条的主要优势是可在10min获得结果，且所有试剂均包含在试纸条中，但该试纸条仅适用于定性测定，测试线的存在与否，仅分别表示样品中SD浓度的低或高。Wang等探讨和建立了一种快速免疫层析法检测鸡蛋和鸡肉中的磺胺嘧啶。基于竞争的反应机理，磺胺嘧啶-BSA偶联物被固定于硝酸纤维素膜的检测区内作为捕获试剂：磺胺嘧啶的单克隆抗体偶联在胶体金颗粒上，作为检测试剂。该半定量测定方法可在15min之内完成。磺胺嘧啶的LOD能达到5ug/kg，且不易被其他SAs干扰；在10ug/kg、20ug/kg和100ug/kg添加水平，鸡蛋的回收率为71%～97%，肌肉为71%～95%。与ELISA方法和HPLC方法结果一致。

相关链接：磺胺类药物残留测定方法（五）

文章来源：《兽药多组分残留分析技术》

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