柱后衍生技术，即利用衍生反应使被测物与相应的试剂之间发生化学反应，以改变被测物的化学和物理性质，使其得到检测。例如，将发色基团或荧光集团键合到样品中去，多级放大检测灵敏度。在许多情况下，反应在室温进行得非常缓慢，因此，反应器可以加热。许多方法需要顺序加入两种或两种以上的试剂，这时可添加一个试剂泵。反应完成后，衍生液体流入检测器进行检测。柱后衍生仪自动将从HPLC流出的洗提液与试剂溶液的液流混合。混合液通过反应器，在反应器内充分反应。

1.柱后衍生通过许多途径提高HPLC的灵敏度

(1)许多选择性试剂可以选择，使被分析物容易被检测。

(2)由于首先对样品进行分离，样品的基质在分析之前被净化或保留在色谱柱上，只有净化后的样品进行反应，省去了大量的样品提纯操作。因为没有基质的干扰，反应的重现性也很好。

氨基甲酸酯是广泛使用的杀虫剂，美国环保署方法USEPA 531.2和官方分析化学家协会AOAC29.A05方法以及NY/T 761中方法均是在柱后将氨基甲酸酯水解后衍生，应用梯度洗脱和荧光检测进行检测。

氨基甲酸酯的一般结构，是N-甲基取代氨基甲酸酯，有不同的成酯基团。氨基甲酸酯的分离，可用C18以水/甲醇梯度洗脱。其出峰顺序根据其相对的疏水性，疏水性最强的最后被洗脱出来。分析过程：氨基甲酸酯首先被氢氧化钠溶液在100℃水解形成醇、碳酸盐和甲胺，然后甲胺与邻苯二甲醛(OPA)反应形成一种高荧光的衍生物，进入荧光检测器被检测。图2-15为某型号柱后衍生仪反应流程。

2.柱后衍生方法的要求标准样品的基线或出峰经常会不理想，不是漂移就是出峰差，可以从以下几点找原因：

(1)试剂的稳定性。试剂必须在运行一批次样品时足够稳定。如果不稳定则信号会相应变化。

(2)反应速度。当衍生试剂与柱洗脱液混合时，反应必须迅速、完全。反应时间越长，反应器容积越大，而反应容积增大会造成峰形变形。

(3)重现性。当衍生试剂与柱洗脱液混合时，反应受到许多因素的影响。反应的重现性，与泵的流速精密度和温度密切相关。所以，泵保持稳定的流速、反应器保持恒定的温度，是至关重要的。

(4)试剂的最低检测信号。试剂(包括其副产物)的荧光背景产生连续的噪声。如果试剂产生的荧光信号高于分析物，那么分析物将会淹没在试剂背景信号中。基线的噪声和背景信号成正比。

图2-15 柱后衍生仪反应流程

(5)溶解性。所有的物质必须处于溶解状态，包括洗提液、试剂和新形成的衍生物。沉淀将堵塞反应管和接头。

(6)流体的不均一性，基线噪声与洗提液和试剂泵的流动噪声有关。不均匀的流速会产生不均匀的混合，导致背景信号噪声。

(7)激发波长与反射波长要根据所检测化合物设置正确。

应用实例：PICKERING柱后衍生氨基甲酸酯分析的柱后条件。

衍生试剂1：水解衍生试剂CB130。

衍生试剂2：100mg邻苯二甲醛(OPA)、2g巯基乙醇溶解于950mL CB 910。

反应器1：100℃，0.5mL。

反应器2：环境温度。

衍生试剂流速：0.3mL/min。

检测：荧光检测器，激发波长λ_ex=330nm，发射波长入λ_em=465nm。

氨基甲酸酯分析柱0846250(4.6mm×250mm)，C₁₈，5um。

氨基甲酸酯分析所用的衍生试剂为水解试剂NaOH。注意：在第一次安装时，试剂瓶、管线和泵应该用甲醇冲洗，以减少可能的荧光背景。

相关链接：液相色谱柱的保养与维护

文章来源：《无机化学核心教程（第二版）》

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