己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)，是一种人工合成的雌性激素类药物，在医学上主要用于治疗雌激素缺乏症。由于其具有调节动物的生理功能、促进动物生长等作用，从20世纪60年代开始，DES曾在猪、鸡、牛、羊的养殖业中作为生长激素被广泛应用。但是己烯雌酚及其代谢产物不能被完全消化吸收，会在动物肝脏、肌肉、蛋、乳中残留，并通过食物链被人体吸收。国内外研究表明，己烯雌酚具有很强的副作用，进入人体会导致体内遗传物质改变，可能引发基因突变及肿瘤。少儿食用残留己烯雌酚的食物，会导致性早熟。男性长期摄入，可产生男性女性化等一系列副作用。

在此介绍用高效液相色谱法测定畜禽肉中己烯雌酚(依据GB/T5009.108-2003)。

1.原理

试样匀浆后，经甲醇提取过滤，注入HPLC柱中，经紫外检测器鉴定。于波长230nm处测定吸光度，同条件下绘制工作曲线，己烯雌酚含量与吸光度值在一定浓度范围内成正比，试样与工作曲线比较定量。

2.试剂

(1)甲醇。

(2)0.043mol/L磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)：取1g磷酸二氢钠溶于水成500mL。

(3)磷酸。

(4)己烯雌酚(DES)标准溶液：精密称取100mg己烯雌酚(DES)溶于甲醇，移入100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，每1mL含DES1.0mg，贮于冰箱中。

(5)己烯雌酚(DES)标准使用液：吸取10.00mL DES贮备液，移入100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，每1mL含DES 100ug。

3.仪器

(1)高效液相色谱仪(HPLC)：具紫外检测器。

(2)小型绞肉机。

(3)小型粉碎机。

(4)电动振荡机。

(5)离心机。

4.操作步骤

(1)提取及净化称取(5±0.1)g绞碎(小于5mm)肉试样，放入50mL具塞离心管中，加10.00mL甲醇，充分搅拌，振荡20min，于3000r/min离心10min，将上清液移出，残渣中再加入10.00mL甲醇，混匀后振荡20min，于3000r/min离心10min，合并上清液，此时若出现浑浊，需再离心10min，取上清液过0.5um FH滤膜，备用。

(2)测定

①色谱参考条件：

检测波长：230nm；灵敏度：0.04 AUFS；流动相：甲醇+0.043mol/L磷酸二氢钠(70+30)，用磷酸调pH=5(其中NaH₂PO₄·2H₂O水溶液需过0.45um滤膜)；流速：1mL/min；进样量：20uL；色谱柱：CLC-ODS-C18(5um)
6.2mm×150mm不锈钢柱；柱温：室温。

②色谱图：己烯雌酚色谱图见图6-7。

图6-7 已烯雌酚色谱图
1—溶剂峰 2—杂质峰 3—已烯雌酚标准峰

③标准曲线绘制：称取5份(每份5.0g)绞碎的肉试样，放入50mL具塞离心管中，分别加入不同浓度的标准溶液(6.0，12.0，18.0，24.0ug/mL)各1.0mL，同时做空白。其中甲醇总量为20.00mL，使其测定溶液浓度为0.00，0.30，0.60，0.90，1.20ug/mL，按前文提取净化方法处理备用。

④测定：分别取样20uL，注入HPLC柱中，可测得不同浓度DES标准溶液峰高，以DES浓度对峰高绘制工作曲线，同时取样液20uL，注入HPLC柱中，测得的峰高，从工作曲线图中查相应含量，R1=8.235。

5.结果计算

式中X——试样中已烯雌酚含量，mg/kg

m₁——试样体积中己烯雌酚含量，ng

m₂——试样的质量，g

V₂——进样体积，uL

V₁——试样甲醇提取液总体积，mL

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文章来源：《食品理化检测技术》

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