(一) 溶血与凝聚检查法

1. 简述本法为将一系列浓度或一定浓度的供试品与2%的兔红细胞悬液混合，温育一定时间后，观察供试品对红细胞状态是否产生影响，以判定供试品是否引起溶血或凝聚的检查方法。

2. 试验条件

(1) 器材：洁净试管、玻璃珠、锥形瓶、移液管、容量瓶、离心机、离心试管、注射器、恒温水浴、显微镜、紫外可见分光光度计等。

(2) 试剂：75%乙醇，蒸馏水，0.9%氯化钠注射液等。

(3) 实验动物：家兔，体重2kg以上，应健康合格，雌雄均可。

3. 供试液配制除另有规定外，按各品种项下规定的浓度配制成供试品溶液。配制供试液的过程应注意无菌操作。

4. 检查方法

(1) 2%红细胞悬液制备：取健康的2kg以上家兔，固定后，使用注射器心脏取血20ml～30ml，快速放入有玻璃珠的锥形瓶中(或用玻璃棒搅动血液)，立即开始振摇10分钟，以除去纤维蛋白原，使成脱纤血液。抽取脱纤血于离心试管中，加入0.9%氯化钠溶液约10倍量，摇匀，1000～1500转/分钟离心15分钟，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按上述方法洗涤2～3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2%的红细胞混悬液，供试验用。

(2) 加入供试液：除另有规定外，取洁净试管5只，编号，1、2号管为供试品管，加入供试品溶液，3号管为红细胞阴性对照管，4号管为溶血阳性对照管，5号管供试液对照管。加液制备见表15-29，依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液、蒸馏水，混匀。

表15-29 溶血与凝集检查温浴试管加液制备表

(3)温浴与观察：加好液后，轻轻振摇混匀，立即置37℃±0.5的水浴中进行温浴，开始每隔15分钟观察或检查1次，1小时后每小时观察1次，最终时间为3小时。观察结果记录在表15-30中。

表15-30 溶血与凝聚检查结果记录表

(4) 溶血判断：①试验管(1、2号)中的溶液呈澄明红色，管底无细胞残留或有少量红细胞残留(必要时可以显微镜下观察)，表明有溶血发生，即溶血阳性，以“+”表示。②试验管(1、2号)中红细胞全部下沉，上清液无色澄明或有色澄明，但1、2号管与5号管比较上清液无显著差异，表明无溶血发生即溶血阴性，以“-”表示。③(非药典推荐方法)试验管(1、2号)上清液有色澄明，但1、2号管与5号管比较上清液颜色有显著差异，可将温浴3小时后的1、2、4、5号试管在1500转/分离心10分钟，抽取各管上清夜在波长545nm处测定吸光度(以0.9%氯化钠注射液为空白调零)，按下式计算供试液管的溶血率，如溶血率大于5%，可认为供试液管与供试液阴性对照管有显著差异，为溶血阳性，以“+“表示。

溶血率(%)=(A-A5)/(A4-A5)×100%.............(式15-14)

式中，A为1号管与2号管吸光度的均值；A4、A5分别为4号管与5号管的吸光度值。

(5)红细胞凝聚判断：①试验管(1、2号)溶液中有棕红色或红棕色絮状沉淀，轻轻倒转3次仍不分散，表明有红细胞凝聚发生，以“①”表示。②试验管(1、2号)溶液中红细胞下沉较3号管明显加快，或出现颗粒状沉淀等与3号管红细胞沉淀有显著不同的，可在温浴3小时后，将1、2、3号管轻轻倒转3次，取细胞悬液1滴于载玻片上，加盖玻片，置显微镜下观察。3号管红细胞应分散均匀，如1、2号管玻片上可见红细胞聚集为少量块状或团状、或可见大量的串状聚集，表明有红细胞凝聚发生，以“①”表示。如1、2号管显微镜下观察红细胞分散情况与3号管无差异，表明无红细胞凝聚发生，以“-”表示。③1、2号管观察3小时红细胞下沉情况与3号管均无显著差异，3小时后轻轻倒转3次1、2号试管红细胞能很快分散均匀，表明无红细胞凝聚发生，以“-”表示。

5. 结果判定除另有规定外，当阴性对照管无溶血与凝聚发生，阳性对照管(4号)有溶血发生时，试验成立；若2支供试品管在3小时内均没有发生溶血与凝聚，判定供试品符合规定；若有1支供试品管在3小时内发生溶血和(或)凝聚，应设4支供试品管进行复试，其4支供试品管的溶液在3小时内均不得发生溶血和(或)凝聚，否则判定供试品不符合规定。

文章来源：《实用中药药品检验检测技术指南》

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