日常检验中，色谱柱的填料和流动相的组分应按药品标准项下的规定，除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。

按照2015年版《中国药典》四部高效液相色谱法(通则0512)规定，各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、商品柱的型号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。

一、 保留时间

保留时间是色谱定性的基础：药品标准中一般均规定检测组分与对照品的保留时间一致。应该明确的是“一致”并不是完全相同。由于每次进样后启动分析有时间差、对照品液与供试品液的环境不同等原因，被测组分峰与对照品峰保留时间都会有微小差别。当检测成分与相邻成分峰的保留时间接近，难以准确判定时，可取对照品或其他对照物加入供试样品中同时进行色谱分析，即加样测定的方法辅助进行判断；对某些峰形不对称的组分，其保留值随进样量而变化，保留值应以最低检测量色谱峰的保留时间作为参考。

二、双柱验证

用已知对照物定性时.不同组分由于保留值的偶然一致性，会产生“假阳性”结果。此时，可选用两根不同型号的商品柱或极性不同的色谱柱进行验证。若保留时间一致，一般可判断为同一成分。

三、进样量

为使色谱的分辨率好，进样量越小越好，但当检测灵敏度较低时，又不得不加大进样量。进样量过大则会形成超载，影响分离效果。对于常规分析柱，进样量一般应小于20ul；用LOOP进样.注入量应不小于LOOP容积的4～5倍，用微量进样器进样，进样体积不能大于LOOP容积的一半。

四、流动相的处理

由于色谱填料粒度很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱堵塞；会增加进样阀的堵塞和磨损以及泵的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。因此，流动相和样品的滤过非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。

流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体(如O₂)，以防止在洗脱过程中当流动相由色谱.柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组分被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光淬灭。

常用的脱气方法有氦气脱气法、加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等：氦气脱气法是利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高；加热回流法效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染；超声脱气法效果最差。在线真空脱气法利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。

五、溶剂过滤器的处理

溶剂被污染以及菌藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其是使用水溶液或磷酸盐缓冲液(pH4～7)，溶剂应严格滤过；避免使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液；避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用棕色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸(35%)中浸泡1小时，然后用二次蒸馏水冲洗干净并超声处理。

六、样品的纯化处理

在中药复杂成分的液相色谱分析中，样品的处理是重要的步骤之一。目的是制成适于进样的均质溶液；使干扰物质相对除净、不致损害色谱柱；将被测物浓缩或衍生化，以改善分离或检测

样品预处理方法包括提取、溶解、稀释、渗漉、超声、蒸发浓缩、固一液萃取、液一液萃取、固相萃取、索氏提取等。研究建立方法时，应根据测定成分的性质、存在的状态，及其含有量的高低，选择合适的方法。既能有效地提取、纯化，排除干扰测定的物质，又能定量转移，便于操作。

文章来源：实用中药药品检验检测技术指南》

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