高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据处理系统组成，如图9-1所示。

图9-1 高效液相色谱仪示意图

一、 输液泵

高效液相色谱的流动相采用高压泵输送，有不同类型的输液泵，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。目前使用较多的是柱塞式往复泵，柱塞式往复泵为恒流泵，可按设定的流速输送流动相，流量不受柱阻力的影响，可保持恒定，并容易清洗和更换。由于柱塞式往复泵是通过柱塞的往复运动进行的，所以输液的脉动性较大。目前多采用双泵补偿的方法减小脉动性。双泵补偿是同时使用两个泵进行工作，两个泵可以按串联或并联方式连接，交替送液，相互补偿，达到减小脉动的目的。

二、 进样器

进样器是将试样送入色谱柱的装置。一般要求进样装置的密封性好，死体积小，重复性好，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。进样器有进样阀和自动进样装置两种。目前，自动进样器已广泛使用，但了解六通进样阀的原理是必要的。在工作状态下，仪器系统内处于高压状态，借助于六通进样阀，实现了常压下不停流进样。六通进样阀的示意图如图9-2所示：

图9-2 六通进样阀示意图
a.装样位置 b.进样位置

六通进样阀可分为定子和转子两部分，共有6个口，故称为六通进样阀。转子通过扳手调节，可以分别处于“装样”和“进样”两个位置。图中a为进样阀处于“装样”位置的情况，此时流动相直接进入色谱柱，样品注入口与样品环连接，用微量进样针将一定体积的样品溶液从样品注入口注入，装于样品管内。当将扳手扳至“进样”位时，进样阀的流路发生了改变，流动相通过样品管，将注入的样品带入色谱柱进行分析。六通进样阀具有使用方便，进样量准确等优点。样品环有10ul、20ul、50ul等不同容积，可以选配。样品环不仅可以用来贮液，也可用来测量样品溶液的体积。将样品环装满后，进样，进样量即为样品环的容积，此种进样方式称为“满环进样”或“定量环进样”。用定量环进样精密度好，在使用外标法时，应使用此种操作方式。

三、 色谱柱

色谱柱是色谱分离的核心。色谱柱管由不锈钢制成，柱长一般为10～30cm，内径为2～5mm。色谱柱使用性能指标包括在一定实验条件下的柱压、理论板数、对称因子、容量因子和选择性因子等。温度会影响色谱柱的分离效果，一般未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60℃。残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2～8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。

(一) 反相色谱柱

以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶(octadecylsilyl silica gel，ODS)、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。

(二) 正相色谱柱

用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用于反相色谱。

(三) 离子交换色谱柱

用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。

(四) 手性拆分色谱柱

用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。

四、 检测器

样品经色谱柱分离后进入检测器进行检测。最常用的检测器为紫外检测器(UVD)，其他常见的检测器有荧光检测器(ED)、蒸发光散射检测器(ELSD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器和质谱检测器等。

按适用范围，检测器可分为选择型和通用型两大类。紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。

紫外检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。

(一) 紫外检测器(ultravioletdetector，UVD)

1. 普通紫外检测器紫外检测器是高效液相色谱中应用最广的一种检测器。用一定波长的单色光照射流通池，流动相携带被分离的组分进入流通池时，流动相在测定波长处不吸收光或吸收很弱，测定组分在该波长处有很强的吸收，记录不同时间对光的吸收度，就得到一张色谱图。组分对光的吸收符合Lambert-beer定律，因此色谱峰的面积和组分的量成正比关系。紫外检测器的特点是灵敏度高，线性范围宽，对温度和流动相的波动不敏感，可用于梯度洗脱。

2. 光二极管阵列检测器(photodiodearraydetector，PDAD)光二极管阵列检测器是一种光学多通道检测器，它可以在瞬间完成对组分的紫外扫描。其原理是由光源发射的光照射流通池，被组分选择性地吸收，透过光通过光栅分光，形成组分的紫外吸收光谱，照射在成矩阵排列的光二极管上，光二极管将光信号转换为电信号，输出的电信号与光的强度成正比，电信号经过累加、处理，就可以得到组分的紫外吸收光谱。因此，使用PDAD，可以在瞬间获得组分的紫外吸收光谱，而不需停流进行紫外扫描。光二极管的个数越多，图谱的分辨率越高，若有512个光二极管，在190～800nm范围内扫描，则平均每1.2nm对应一个光二极管。

用PDAD按设定的时间间隔采集数据，可以得到一张三维的光谱-色谱图，可辅助用于组分的定性比较。

应用PDAD检测器还可以对峰的纯度进行检查。若一个色谱峰包含有两个组分，则不同位置的紫外吸收光谱会有差异，通过比较色谱峰不同位置的紫外光谱的一致性，可以进行色谱峰的纯度检查。

(二) 荧光检测器(fluorescencedetection)

荧光检测器是利用组分发出的荧光进行检测的方法。荧光检测器的灵敏度比紫外检测器高，检测限可以达到1×10-10g/ml，但组分必须有荧光。许多药物和生物活性物质具有天然荧光，能直接检测，如生物碱、维生素和甾体化合物等；通过荧光衍生化还可以使本身没有荧光的化合物转变成荧光衍生物，从而扩大了荧光检测器的应用范围，例如氨基酸。由于荧光检测器的高灵敏度和选择性，它是残留物、体内药物分析常用的检测器之一。

(三) 蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector，ELSD)

蒸发光散射检测器是在90年代出现的一种新型的通用型检测器，主要适用于无紫外吸收，不能用紫外检测的组分，如糖类、脂肪酸、甘油三酯及一些萜类等。

ELSD的检测可分为三个步骤：

1. 雾化 在雾化器中，洗脱液通过1个针孔与氮气(也可以用空气)混合，形成均匀的雾状液滴。

2. 流动相蒸发 液滴通过加热的漂移管时，流动相被蒸发，样品组分形成气溶胶，进入检测室。

3. 检测 在检测室内，用激光来照射气溶胶，产生散射，测定散射光强度，记录散射光强度随时间的变化关系，得到色谱图。

气溶胶受固定光强的激光照射后，待测组分的质量(m)和散射光强度(I)有以下的关系

I=Kmb lgI=blgm+lgK..........(式9-1)

式中，K和b为与蒸发室温度和流动相性质有关的常数。上式表明散射光的对数响应值与组分的质量的对数成线性关系。

ELSD用来测定不能用紫外检测器检测的组分，对高效液相色谱的检测是很重要的补充。但是，它只适合流动相能完全挥发的色谱条件，若流动相含有难以挥发的无机酸、碱或盐类，就不能用ELSD进行检测。

五、 数据处理系统

数据处理系统可以是简单的记录仪，而目前应用的大部分高效液相色谱仪都有微机处理控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。

文章来源：《食品安全国家标准汇编食品添加剂(五)》

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