4.3 剂量及分组

动物按体重随机分组,试验至少设三个受试物组和一个对照组。如果受试物使用溶剂，对照组应给予溶剂的最大使用量。如果受试物引起动物食物摄入量和利用率下降时,那么对照组动物需要与试验组动物配对喂饲。某些受试物的高剂量受试物组设计应考虑其对营养素平衡的影响，对于非营养成分受试物剂量不应超过饲料的5%。

在受试物理化和生物特性允许的条件下，最高剂量应使F₀和F₁代动物出现明显的毒性反应，但不引起动物死亡；中间剂量可引起轻微的毒性反应；低剂量应不引起亲代及其子代动物的任何毒性反应。如果受试物的毒性较低，1000mg/kg体重的剂量仍未观察到对生殖发育过程有任何毒副作用，则可以采用限量试验，即试验不再考虑增设受试物其他剂量组。若高剂量的预试验观察到明显的母体毒性作用,但对生育无影响，也可以采用限量试验。

4.4 试验步骤

4.4.1 受试物给予

4.4.1.1 试验期间，所有动物应采用相同的方式给予受试物；如受试物经灌胃给予，灌胃频次按每天1次，每周7天给予受试物。各代大鼠给予的受试物剂量(按动物体重给予,mg/kg体重或g/kg体重)、饲料和饮水相同。

4.4.1.2 根据受试物的特性或试验目的，可将受试物掺入饲料、饮水或灌胃给予。首选掺入饲料,若受试物加入饲料或饮水中影响动物的适口性,则应选择灌胃给予受试物。

4.4.1.3 受试物灌胃给予,要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄油、玉米油等)，不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物应现用现配,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。应每日在同一时间灌胃1次,每周称体重两次,根据体重调整灌胃体积。灌胃体积一般不超过10mL/kg体重，如为水溶液时,最大灌胃体积可达20mL/kg体重；如为油性液体,灌胃体积应不超过4mL/kg体重；各组灌胃体积一致。

4.4.1.4 受试物掺入饲料或饮水给予,要将受试物与饲料(或饮水)充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则，受试物掺入饲料比例一般小于质量分数5%,若超过5%时(最大不应超过10%),调整对照组饲料营养素水平(若受试物无热量或营养成分,且添加比例大于5%时,对照组饲料应填充甲基纤维素等,掺入量等同高剂量)，使其与剂量组饲料营养素水平保持一致;亦可视受试物热量或营养成分的状况调整剂量组饲料营养素水平,使其与对照组饲料营养素水平保持一致。受试物剂量单位是每千克体重所摄入受试物的毫克(或克)数，即mg/kg体重(或g/kg体重)，当受试物掺入饲料其剂量单位亦可表示为mg/kg(或g/kg)饲料，掺入饮水则表示为mg/mL水。受试物掺入饲料时,需将受试物剂量(mg/kg体重)按动物每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度(mg/kg饲料)。

4.4.2 试验方法

选用断乳后7周～9周的F0代雌、雄鼠，适应3d～5d后开始给予受试物，至交配前至少持续10周。交配结束后，对F₀代雄鼠进行剖检。在3周交配期、妊娠期，直到子代F₁断乳整个试验期间，F₀代雌鼠每天给予受试物。F₁代仔鼠断乳后，给予受试物,并一直延续直到F₂代断乳。试验期间根据受试物的代谢和蓄积特性,可适当调整给予剂量(试验程序见表1)。

表1 大鼠生殖发育试验程序

4.4.3 交配

4.4.3.1 生殖发育毒性试验可用1：1(1雄：1雌)或1：2(1雄：2雌)交配。

4.4.3.2 每次交配时,每只雌鼠应与从同一受试物组随机选择的单只雄鼠同笼(1:1交配)，配对同笼的雌、雄鼠应作标记。所有雌鼠在交配期应每天检查精子或阴栓,直到证明已交配为止,并在证明已交配后尽快将雌、雄鼠分开。查到精子或阴栓的当天为受孕0d。

4.4.3.3 子代1大鼠鼠龄13周才可交配。对子代F₁的交配，同一受试物组中每窝随机选择与另一窝仔鼠1：1交叉交配产生子代F₂。参与交配的仔鼠,每窝雌、雄至少各有1只，且应随机抽出，而不应按体重选择。没有被选中的F₁代雌性和雄性仔鼠至F₂代仔鼠断乳时处死。

4.4.3.4 如果经过3个发情期或两周仍未交配成功，应将交配的雌、雄鼠分开,不再继续同笼。同时应对不育的动物进行检查,分析其原因。另外,也可将未成功交配的动物与证实过生育功能正常的动物重新配对,并在需要时进行生殖器官的病理组织学、发情周期和精子发生周期的检查。

4.4.3.5 由于受试物的毒性作用导致窝仔鼠数目无法达到试验要求，或在第一次交配过程中观察到可疑的变化和结果时,可进行亲代(F₀代)或子一代大鼠(F₁代)的第二次交配。第二次交配时,推荐使用未交配的雌(雄)大鼠与已交配过的雄(雌)大鼠进行。第二次交配一般在第一次交配所产幼鼠断乳后1周进行。

4.4.4 每窝仔鼠数量的标准化

F₀和F₁代母鼠妊娠和哺乳期间给予受试物,断乳期结束后处死。F₁代仔鼠出生后第4天，采用随机的方式(而不是以体重为依据)，将每窝仔鼠数目进行调整,剔除多余的仔鼠,达到每窝仔鼠性别和数目的统一。每窝尽可能选4只雄鼠和4只雌鼠，也可根据实际情况进行部分调整，但每窝应不少于8只幼鼠。F₂代仔鼠按照同样的方式进行调整。

相关链接：生殖发育毒性试验（一）

文章来源：《食品安全国家标准汇编检验方法（二）》

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