3.3 仪器和设备

3.3.1 天平：量程2 kg，感量0.1g；量程2 kg，感量0.01g。

3.3.2 实时荧光PCR仪。

3.3.3 冷冻离心机。

3.3.4 pH计。

3.3.5 移液器：2 uL～10uL、10uL～100uL、100uL～1000uL。

3.3.6 振荡器。

3.3.7 研钵及粉碎装置。

3.4 检测程序

过敏原花生成分实时荧光PCR检测程序见图1。

图1 过敏原花生成分实时荧光PCR检测程序图

3.5 步骤

3.5.1 制样方法

称取约200 g样品，用洁净研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至粉末状。

3.5.2 模板DNA提取

3.5.2.1 CTAB法

称取300 mg已制备好的样品至2 mL离心管中，加入600uL CTAB(若样品吸水性强适当增加CTAB加入量)、40uL 蛋白酶K，振荡均匀，65℃温育30 min；加入500uL酚：三氯甲烷，异戊醇(25：24：1)，强烈振荡，12000r/min离心15 min；吸取上层水相至1.5 mL离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10 min；弃上清液，用预热至65℃ TE缓冲液溶解DNA(TE量视DNA沉淀的多少而定)；加入5 uL RNA酶溶液，37℃温育30 min；加入200uL三氯甲烷：异戊醇(24:1)，强烈振荡，12000r/min离心15 min；吸取上层水相至新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，振荡均匀，12000r/min离心10 min；弃上清液，加入70％乙醇小心清洗沉淀DNA,12000r/min离心1 min；弃上清液，干燥，加预热至65℃ TE缓冲液溶解DNA。每个样品做两个平行样，同时设立试剂提取对照(以水代替样品)。

3.5.2.2 商品化试剂盒方法

商品化基因组提取试剂盒，使用时按照操作说明书进行操作。

3.5.2.3 所提取样品DNA的质量评估

样品中提取的DNA用紫外分光光度法检测，分别计算核酸的纯度及浓度，计算见式(1)、式(2)：

DNA纯度＝OD_{260 nm}/OD_{280 nm}······(1)

比值在1.7～2.0之间较好，符合PCR检测要求。

双链DNA浓度(ug/mL)=50×OD_250nm······(2)

3.5.3 实时荧光PCR扩增

3.5.3.1 反应体系

10×PCR缓冲液5uL、引物对(10 umol/L)各2 uL、探针(10 umol/uL)1.5 uL、dNTP (10mmol/L)1uL、Taq DNA热启动聚合酶(5 U/uL)0.5uL、模板DNA 0.1ug～2ug、补水至50uL。

3.5.3.2 反应参数

预变性95℃10 min, 1个循环；95℃ 15 s, 60℃ 1 min，同时收集FAM荧光，进行45个循环。

3.5.4 质控设置

进行检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照、提取对照。

3.5.4.1 阳性对照

以花生DNA为模板或采用含有扩增片段(花生Ara h²基因序列)的质粒DNA作为模板。

3.5.4.2 阴性对照

采用非花生成分的DNA作为模板。

3.5.4.3 提取对照

采用试剂提取对照作为模板。

4 结果分析及判定

4.1 基线的设置

实时荧光PCR反应结束后进行结果分析时，应设置基线范围。基线范围选择一般在6个～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值不出现任何数值为准。

4.2 质控标准

阴性对照：无荧光增幅现象。

提取对照：无荧光增幅现象。

阳性对照：Ct值≤30.0，并且曲线有明显的荧光增幅现象。

以上指标有一项不符合均视为此次实验无效。

若阴性对照或提取对照出现荧光增幅现象，说明在样品提取或反应体系中存在污染，可能出现检测结果假阳性。阳性对照结果无荧光增幅现象，说明反应体系存在问题，检测可能出现假阴性结果。根据对照结果分析问题，重新检测样品。

4.3 结果判定

检测样品无荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定该样品中未检出过敏原花生成分。
检测样品Ct值≤40.0，曲线有明显的荧光增幅现象，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定该样品中检出过敏原花生成分。

检测样品Ct值在40.0～45.0之间，应重做实时荧光PCR反应。再次扩增后的结果Ct值仍在40.0～45.0之间，并且阳性对照、阴性对照、提取对照结果正常者，可判定样品中检出过敏原花生成分，否则判定该样品中未检出过敏原花生成分。
两个平行样中只要有一个样品检测为阳性，即可判定该样品中检出过敏原花生成分。

相关链接：实时荧光PCR法检测花生成分（一）

文章来源：《食品化妆品检验卷无机元素和放射元素及其他检测方法》

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