5 仪器

5.1 均质器：转速不低于5000r/min。

5.2 离心机：转速不低于4000r/min。

5.3 旋转蒸发器。

5.4 恒温水浴锅。

5.5 生化培养箱：(35±1)℃。

5.6 高压灭菌器。

5.7 培养皿：内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。

5.8 牛津杯：不锈钢小管，外径(8.0±0.1)mm，内径(6.0±0.1)mm，高度(10.0±0.1)mm。

5.9 游标卡尺：测量范围0 mm～200mm，精度±0.02 mm。

6 试样的制备与保存

6.1 试样的制备

将样品搅拌均匀。分出0.5 kg作为试样，制备好的试样置于样品瓶中，密封，并加以标识。

6.2 试样的保存

将样品于常温下保存。

7 测定步骤

7.1 提取

称取10 g试样，精确到0.01g，置于50 mL离心管中，用2×20 mL甲醇(4.1.1)均质1 min(4000r/min)后离心20 min (4000r/min)。合并两次离心的上清液于200 mL分液漏斗中。

7.2 净化

7.2.1 甲醇萃取

在上述上清液(7.1)中加入20 mL正己烷(4.1.2)充分振荡1 min，静置分层，将下层的甲醇相移入另一200 mL的分液漏斗中。

7.2.2 三氯甲烷萃取

在上述甲醇相(7.2.1)中加入2 mL氢氧化钠溶液(4.4.1)和30 mL三氯甲烷(4.1.3)充分振荡1 min，再加入30 mL磷酸氢二钠溶液(4.4.2)，振荡1 min，静置15 min～20min。将三氯甲烷相移入50 mL的容量瓶中，并用三氯甲烷定容至刻度，混匀。量取其中25 mL于150mL鸡心瓶中，在40℃水浴的旋转蒸发器上蒸发至干。加入5 mL磷酸盐缓冲溶液(4.4.3)溶解残渣。此溶液含试样量为1.0g/mL。

7.3 测定

7.3.1 菌悬液用量的测定

在实际测定前，将不同浓度的菌悬液(4.7)加入定量的培养基3(4.6.3)中培养，能使0.05ug/mL浓度的红霉素标准工作溶液(4.5.2)产生直径大于10 mm、清晰、完整的抑菌圈为最适菌悬液用量。

7.3.2 检定用平板的制备

将从7.3.1测试所得的最适菌悬液用量加入已溶化并冷至55℃左右的培养基3(4.6.3)中，充分混匀并立即倾注在灭菌培养皿中，每平皿加入量为9.0 mL。置水平台上凝固后，在每个检定用平板中放置六个牛津杯，使每个牛津杯在半径为2.8 cm的圆面成600角间距。所用平板应当天制备。

7.3.3 标准曲线的制备

红霉素标准工作溶液(4.5.2)0.80、0.40、0.20、0.10和0.05 ug/mL五个浓度中，0.20ug/mL标准工作溶液为参考浓度。

每个红霉素标准工作溶液浓度除参考浓度(0.20ug/mL)外，各取三个检定用平板为一组，四组共12个检定用平板。每个检定用平板中的三个牛津杯内注满参考浓度(0.20ug/mL)标准工作溶液，另三个牛津杯中则分别注满其他浓度的标准工作溶液。这样参考浓度(0.20ug/mL)标准工作溶液将得出36个抑菌圈直径读数的数据，其他浓度标准工作溶液将各得九个抑菌圈直径读数的数据。

盖好陶瓦盖，置(35±1)℃培养18h±1h后取出，翻转平板，除去牛津杯，执游标卡尺准确地测量各抑菌圈直径(精确到0. 1 mm)，求出各组平板中标准工作溶液浓度及参考浓度(0.20ug/mL)抑菌圈直径读数的平均值以及参考浓度(0.20ug/mL) 36个抑菌圈直径读数的总平均值。用参考浓度(0.20ug/mL)的总平均值减去各组参考浓度(0.20ug/mL)的平均值之差为校正值，以此值校正其他各浓度标准工作溶液以及被测样品溶液抑菌圈直径读数的平均值。

将各组校正值代入式(1)和式(2)中，求出L和H值后，在半对数坐标上，以抑菌圈直径(mm)为纵坐标(算术级)，以标准工作溶液浓度(ug/mL)为横坐标(对数级)，标出L和H点，连一直线，即为标准曲线。

L-(3a+2b＋c-e)/5······(1)

H-(3e+2d＋c-a)/5······(2)

式中：

L—标准曲线上最低浓度(0.05ug/mL)的抑菌圈直径，单位为毫米(mm);

H—标准曲线上最高浓度(0.80ug/mL)的抑菌圈直径，单位为毫米(mm);

c—参考浓度(0.20ug/mL)抑菌圈直径的总平均值，单位为毫米(mm);

a、b、d、e—分别表示标准曲线中其他各浓度标准工作溶液(0.05、0.10、0.40、0.80 ug/mL)抑菌圈直径数据的校正值，单位为毫米(mm)。

文章来源：《常用兽药残留量检测方法》

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