10．系统适用性试验 色谱方法确立后，应根据该药物原料药的合成工艺或制剂处方特点进行系统适用性试验。系统适用性试验主要包括理论板数(n)、分离度(R)、拖尾因子(T),灵敏度和重复性等五个参数。

早期国内药品标准中大多仅以理论塔板数作为色谱系统适用性要求。但由于市场上色谱柱及色谱填料的品牌及类型很多，不同品牌色谱填料之间以及同种品牌不同批次填料之间有差异，仅仅满足理论塔板数指标并不能完全保证在不同时间、不同仪器或不同实验室进行分析时都能得到一致的分离效果，并且药品质量标准中对理论塔板数的规定从文字表述上也显得过于严苛。因此，从2005年版药典开始，在文字上作了弱化处理，去掉了“理论板数按xxx计算应不低于xxx”中的“应”字。当然，在质量标准中采用杂质对照品或者系统适用性用混合对照品作为分离度试验要求是对分离能力最为直接的要求。因此，从2005年版药典开始，如果有明确的分离度指标，可以不再规定理论板数的要求。

在进行分离度要求时，一般选取与主成分最难分离的杂质作为指示性杂质来规定分离度要求，通常情况下规定主成分与相邻杂质峰的分离度应不低于1.5。

色谱法对主成分及杂质的定性定量分析的前提是色谱峰为单一流出峰，如有共流出物的存在，会直接导致分析方法验证的失败，故一般在分析方法开发初期即需对目标色谱峰是否为单一峰进行检查。采用DAD检测器可以对各成分的光谱纯度进行分析，结合其他分析手段可确认主成分色谱峰的纯度。然而在用DAD检测器进行峰纯度检查时，往往出现明显存在杂质峰，峰纯度检查却显示通过或已确认为单一峰，可峰纯度检查却无法通过的现象。此时，须对可能影响DAD检测器纯度检查的因素进行排查，以便对结果做出正确的判断。DAD检测器进行纯度检查的基础是各成分间紫外光谱存在差异，但也会有杂质与主成分的紫外光谱无明显差异或完全一致的情况，这种情况下用DAD进行色谱峰纯度检查就无能为力了。

对于制剂的分析，除进行上述考察外，还应考察各种辅料对杂质的检出是否有干扰，比如辅料峰是否与杂质峰有重叠。如果有干扰，可以用其他无干扰的辅料替代或对色谱系统进行调整，比如通过流动相中水相和有机相的比例进行调整、流动相pH值的调节(可以对水相进行pH值调节或直接在流动相中加入酸或碱)。需要注意的是，在流动相经过调节后，要考察主成分或杂质在新流动相中的溶解性，流动相的调节不能影响药物或杂质与流动相的相容性。除特殊情况外，样品溶液的制备应该尽量采用流动相作为溶剂。

以甲钴胺原料药中有关物质检查为例，甲钴胺是维生素B₁₂在体内的活性形式，参与变位作用、转甲基作用、脱羧基作用等生化反应。维生素B₁₂衍生物的结构式如图14-14所示。甲钴胺中的有关物质包括：维生素B₁₂羟钴胺、腺钴胺等。

某企业以水为溶剂制备样品溶液，采用氨基柱进行有关物质检查，当进样体积超过2ul时，主峰为双峰(图14-15)，改用C₁₈和C₈色谱柱时，相同流动相条件下，即使用水为溶剂溶解样品，甲钴胺在色谱柱上都是一个色谱峰。进一步的试验表明，用不同pH值的磷酸溶液配制供试品溶液，在极性的氨基柱上，进样体积超过2ul甲钴胺色谱峰仍然是双峰，说明pH值对色谱行为没有影响，样品溶液中水的比例会影响甲钴胺的色谱行为，改用流动相溶解样品后，色谱峰的形状不再受进样体积的影响(图14-16)。

图14-14 维生素B₁₂类药物的化学结构
X:-CN维生素B₁₂(氰钴胺)；-OH羟钴胺；-H₂O水钴胺；-CH₃甲钴胺；
-C1氯钴胺；-SO₃ 硫酸钴胺；-NO亚硝酸钴胺；-脱氧腺昔基 钴胺素辅酶

图14-15 以水为溶剂的甲钴胺色谱图
色谱柱：Kromasil NH₂柱250mm×4.6mm
流动相：乙腈-0.3%磷酸(74：26, pH＝2.5)
检测波长：361 nm

图14-16 以流动相为溶剂的甲钴胺色谱图
色谱柱：Kromasil NH₂柱250mm×4.6mm
流动相：乙腈-0.3%磷酸(74：26，pH=2.5)
检测波长：361nm

采用C₁₈柱，建立了离子对液相色谱方法，甲钴胺及其有关物质维生素B₁₂,羟钴胺获得了完全分离(图14-17)，但出峰顺序与氨基柱相反(图14-18)。

图14-17 维生素B₁₂、羟钴胺、甲钴胺对照品混合样品分离色谱图
1．维生素B₁₂;2.羟钴胺；3.甲钴胺
色谱柱：Kromasil 100A C₁₈柱250mm×4.6mm
流动相：乙腈-2mmo1/L磷酸缓冲液(20：80, pH=3.5，含己烷磺酸钠4.7mg/ml)
检测波长：266nm

图14-18 甲钴胺与有关物质在氨基柱中的分离色谱图(流动相溶解样品)
1．甲钴胺；2.羟钴胺；3．维生素B₁₂

系统适用性试验中应注意不同国家药品标准对理论塔板数和分离度计算公式的差异，不同的色谱工作站对色谱参数的计算也不同，应根据药品注册和销售所在国家的规定，采用相应的计算公式或色谱工作站的正确选项来评价系统适用性。

为满足系统适用性试验要求，色谱参数如流动相比例等可在方法学验证的范围内进行调整。 采用一个法定HPLC方法进行有关物质检查时，可在药典规定的范围内对色谱参数进行调整。USP、EP以及《中国药典》通则中均给出了明确的调整要求(表14-5)。例如：《中国药典》2015年版规定除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒度、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等均可适当改变。值得注意的是，在《中国药典》2005年版中，对流动相比例的调整范围没有做出明确规定，到了2010年版，则明确规定了流动相比例的调整范围,2015年版较2010年版又有所改变，2015年版规定调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33％时，允许改变范围为0.7X～1.3X,当X大于33％时，允许改变的范围为X-10%～X+10%。

表14-5 USP39、EPB.6及《中国药典》2015年版中对液相色谱系统参数进行调整的规定

相关链接：HPLC法应用于有关物质检查时需要注意的问题（五）

文章来源：《实用化学药品检验检测技术指南》

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