食品中氨基酸的检测方法主要有紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法和气相色谱法等。其中高效液相色谱法是常用的方法，可分两大类：①柱后衍生法：由于大多数氨基酸在紫外-可见光区无吸收、无荧光特性，需将分离后的氨基酸衍生、转化为具有紫外-可见吸收或能产生荧光的物质才能检测。国家标准分析方法(GB/T 5009.124)采用阳离子交换色谱分离氨基酸，以茚三酮为柱后衍生试剂进行检测。该技术已经实现了商品化，成为氨基酸自动分析仪。也可用荧光胺、邻苯二甲醛代替茚三酮作为柱后衍生试剂，采用荧光检测。②柱前衍生法：将氨基酸在柱前衍生，衍生产物再通过反相色谱分离，用紫外或者荧光检测器检测。相对柱后衍生法，柱前衍生法具有省时、仪器配置简单的优势。目前，比较常用的衍生试剂是异硫氰酸苯酯和邻苯二甲醛。

(一)氨基酸分析仪法

1．原理食物中的蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液生成具有紫外吸收的蓝紫色化合物，再经分光光度法测定氨基酸含量。反应式如下。

2．分析步骤

(1)样品处理：称取适量样品放入水解管中，加入稀盐酸和数滴新蒸馏的苯酚，充氮气，封口，在110℃恒温水解22小时后，过滤，用去离子水定容。取滤液真空干燥，残留物再用水溶解，干燥蒸干后加缓冲溶液(pH 2.2)溶解。

(2)样品分析：取适量混合氨基酸标准液和样品溶液，分别用氨基酸自动分析仪进行测定，根据保留时间定性，标准曲线法定量。标准溶液的出峰顺序和保留时间见表4-2，标准图谱如图4-3。

3．方法说明

(1)如果样品中含有脂肪、核酸、无机盐等杂质，必须将样品预先去除杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方法是：①去除脂肪：取研碎或匀浆样品干燥后，加入丙酮或乙醚等有机溶剂，混匀后离心或过滤抽提；②去除核酸：将样品在氯化钠溶液中加热，用热水洗涤，过滤后将沉淀用丙酮淋洗，干燥；③去除无机盐：样品水解后含有大量无机盐时，可用阳离子交换树脂处理。

(2)本法最低检出限为10pmol。在酸水解时，色氨酸会完全破坏，不能检出；半胱氨酸部分氧化，不能准确测定；天冬酰胺和谷氨酰胺分别会转化成天冬氨酸和谷氨酸而导致无法测定。

表4-2 氨基酸标准出峰顺序和保留时间

图4-3 氨基酸的标准图谱(氨基酸分析仪)

(二)柱前衍生高效液相色谱法

1．原理食品中的蛋白质经盐酸水解成游离氨基酸后，与异硫氰酸苯酯进行衍生反应，氨基酸衍生产物经高效液相色谱反相C₁₈柱分离后，紫外检测器检测，标准曲线法定量。

2．分析步骤

(1)样品处理：①对于蛋白质样品，取适量样品于水解管中，充氮气，加入盐酸和几滴新蒸馏的苯酚，再充氮气后抽真空封口，在110℃加热22小时，冷却后过滤、定容；②对于游离氨基酸，取适量固体样品加入盐酸提取氨基酸；对液体样品用水稀释至合适浓度。

(2)衍生化反应：准确取氨基酸标准工作液或适量样液，加入异硫氰酸苯酯的乙腈溶液和三乙胺-乙腈溶液后，室温下放置1小时，再加入乙酸溶液。向上述衍生后的样液中加入正己烷，待静置分层后，取下层样液，经0.45 um滤膜过滤后，用于色谱分析。

(3)测定：色谱条件为c₁₈柱(250mm×4.6mm, 5 um)；检测波长：254nm；柱温：40℃；进样量:10ul。流动相A:醋酸钠-乙腈(97+3,pH 6.20)溶液；流动相B：乙腈-水(4+1)。线性梯度洗脱。流速：1.0ml/min。

以保留时间定性，标准曲线法定量。标准色谱图见图4-4。

图4-4 柱前衍生高效液相色谱法氨基酸标准溶液色谱图

天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、丝氨酸(ser)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、精氨酸(arg)、γ-氨基T酸(gaba)、
苏氨酸(thr)、丙氨酸(ala)、脯氨酸(pro)、酪氨酸(tyr)、缬氨酸(val)、蛋氨酸(met)、异亮氨酸(ile)、
亮氨酸(leu)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、赖氨酸(lys)

3．方法说明异硫氰酸苯酯对色谱柱的硅胶键损伤较大，会造成色谱柱填料老化，缩短色谱柱的使用寿命，应尽可能将过剩的异硫氰酸苯酯除去，再进行色谱分离。本法氨基酸检出限1 pmol。

文章来源：《食品理化检验》

版权与免责声明：转载目的在于传递更多信息。

如其他媒体、网站或个人从本网下载使用，必须保留本网注明的"稿件来源"，并自负版权等法律责任。

如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起两周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。