当脲被小心加热至150～160℃时，两分子问脱去一个氨分子形成双缩脲，双缩脲在碱性条件下，能与硫酸铜生成紫红色配合物，称为双缩脲反应，由于蛋白质分子中有肽键(一CO—NH )，与双缩脲结构相似，故也能呈现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸光光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为560nm。

1．标准曲线的绘制

以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质样品。按蛋白质含量40mg、50mg、60mg、70mg、80rag、90mg、]OOmg、llOmg分别称取混合均匀的标准蛋白质样于8支50mL纳氏比色管中，然后各加入lmL四氯化碳，再用碱性硫酸铜溶液(①或②)准确稀释至50mL，振摇lOmin，静置lh，取上层清液离心5min(2000r／min)，取离心分离后的透明液于比色皿中，在560nm波长下以蒸馏水作参比液，调节仪器零点并测定各溶液的吸光度值，以蛋白质的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

2．样品的测定

准确称取样品适量(即使得蛋白质含量在40～llOmg)于50mL纳氏比色管中，加lmL四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度值。用测得的吸光度值在标准曲线上可查得蛋白质的质量(mg)，由此求得蛋白质含量。

3．结果计算

X=m*100/m1

式中 X——样品中蛋白质的含量，mg／lOOg。
m——由标准曲线上查得的蛋白质含量，mg；
m1一一样品质量，g。

4．试剂

①碱性硫酸铜溶液。

a．以甘油为稳定剂，将10ml。10mol／L氢氧化钾和3.0ml甘油加到937mL蒸馏水中，剧烈搅拌(以免生成氢氧化铜沉淀)，同时慢慢加入40ml。14％硫酸铜溶液。 b．以酒石酸钾钠作稳定剂，将10mI。10mol／L氢氧化钾和20mL 25％酒石酸钾钠溶液加到930mL蒸馏水中，剧烈搅拌(否则将生成氢氧化铜沉淀)，同时慢慢加入40mL 4％硫酸铜溶液。

②四氯化碳。

5．仪器

①分光光度计。

②离心机。

6．注意事项

①蛋白质的种类不同，对发色程度的影响不大。

②标准曲线做完整之后，无需每次再做标准曲线。

③含脂肪高的样品应预先用醚脱脂。

④样品中有不溶性成分存在时，会给比色测定带来困难，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测定。

⑤当肽链中含有脯氨酸时，若有大量糖类共存，则显色不好，测定值偏低。

⑥本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定。