四环素类药物是以四并苯为母核的一族抗生素，在畜牧业生产中四环素、土霉素、金霉素等主要用于疾病的治疗和预防及促进生长。但该类药物过量使用会导致畜产品中高浓度药物残留，不仅直接影响消费者身体健康，而且会导致细菌耐药性增加。

目前报道的土霉素、四环素等药物残留量的分析方法有微生物法、薄层色谱法、高效液相色谱法、高效液相色谱-串联质谱法和ELISA法等。每种方法各有优缺点，其中ELISA法灵敏度较高、特异性强、测定方法简单快速，可同时筛选检测大量样品。因此，目前常将ELISA法作为筛选方法，高效液相色谱作为准确定量的方法。该检测方法可以同时测定4种兽用四环素类药物残留量。现以乳制品为对象，用高效液相法同时测定其土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留情况，这也是GB/T 22990-2008介绍的方法。

(一)测定原理

用0.1mol/L Na₂ EDTA-Mellvaine缓冲溶液提取试样中四环素族抗生素残留，Oasis HLB或相当的固相萃取柱和羧酸型阳离子交换柱，用配有紫外检测器的液相色谱仪测定，外标法定量。

(二)主要试剂和设备

1．试剂

甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、磷酸氢二钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、草酸，所有试剂均为分析纯。

0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取71. 63g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。

0.1mol/ L柠檬酸溶液：称取21.04g柠檬酸，用水溶解，定容至1000 mL。

Mcllvaine缓冲溶液：将625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液与1000mL 0.1mol/L柠檬酸溶液混合，必要时用NaOH或HC1调pH 4.0±0.05。

0.1 mol/L Na₂ EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：称取60.50g乙二胺四乙酸二钠放入1625 mLMcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。

0.01 mol/L草酸溶液：称取1.26g草酸，用水溶解，定容至1000 mL。

甲醇-水(1+19)：量取5mL甲醇与95 mL水混匀。

0.01mol/L草酸-乙腈溶液(1+1)：量取50mL草酸溶液与50mL乙腈混匀。

0.1mg/mL土霉素、四环素、金霉素、强力霉素(这四个标样纯度均要大于等于96％)标准储备液：准确称取适量四个标准品，分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液于-20℃保存。

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准工作液：根据需要用流动相将土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备液稀释成所需浓度的混合标准工作溶液，贮存于冰箱中，每周配制。

Oasis HLB固相萃取柱(或同类柱)：500mg、6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。

羧酸型阳离子交换柱：500mg、6mL。使用前用5mL甲醇处理，保持柱体湿润。

2．主要设备

液相色谱仪(配有紫外检测器)，冷冻离心机(转速大于5000r/min )，涡旋振荡器，固相萃取装置，氮气吹干仪等。

(三)测定步骤

1．试样的制备

将牛乳从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。牛乳置于0～4℃冰箱中避光保存，乳粉常温避光保存。

2．提取

牛乳试样称取10g(精确到0.01g)，置于50mL具塞塑料离心管中。乳粉试样称取2g(精确到0.01g)，置于50mL具塞塑料离心管中。向试样中加入20mL 0.1 mol/L Na₂ EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，于涡旋振荡器上混合2 min，于10℃，5000r/min离心lomin，上清液过滤至另一离心管中。残渣中再加入20 mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液。

3．净化

将上清液通过处理好的Oasis HLB柱，待上清液完全流出后，用5mL甲醇-水淋洗，弃去全部流出液。减压抽干5 min，最后用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中。

将收集的洗脱液通过羧酸型阳离子交换柱，待洗脱液全部流出后，用5 mL甲醇洗柱，减压抽干，用4 ml, 0.01 mol/L草酸-乙腈溶液洗脱，收集洗脱液于10 mL样品管中，45℃氮气吹至1.5 mL左右，流动相定容至2mL,洪液相色谱-紫外检测器测定。

4.测定条件

液相色谱参考条件：色谱柱：Kromasil 100-5C₁₈，5um, 150mm×4.6mm(内径)或相当者；流动相：0.01mol/L草酸溶液-乙腈-甲醇(77+18+5)；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；检测波长：350nm；进样量：60uL。

5．液相色谱测定

将混合标准工作液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为3.09、3.73、8.27和12.53 min。

6．结果计算

被测物残留量的测定按下式计算：

式中X_i—试样中被测组分残留量，ug/kg;

P—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，ng/mL ;

V—样品溶液定容体积，mL ;

m—样品溶液所代表试样的质量，g。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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