GB/T 22325-2008规定了高效液相色谱法测定小麦粉中过氧化苯甲酰含量的方法。本方法最低检出限为0.5 mg/kg。

(一)测定原理

由甲醇提取的过氧化苯甲酰，用碘化钾作为还原剂将其还原为苯甲酸，高效液相色谱分离，在230nm下检测。

(二)试剂和仪器

1. 试剂

本标准所用试剂除特别注明外，均为分析纯试剂，实验用水应符合GB/T 6682规定的一级水要求。

(1)甲醇色谱纯。

(2)碘化钾溶液500g/L水溶液(质量浓度)。

(3)苯甲酸标准品纯度≥99.9%。

(4)乙酸铵缓冲溶液(0.02mol/L)称取乙酸铵1.54g用水溶解并稀释至1L,混匀后用0.45um的滤膜过滤后使用。

(5)苯甲酸标准贮备溶液(1mg/mL)称取0.1g(精确至0.0001g)苯甲酸，用甲醇稀释至100mL。

2.器及设备

高效液相色谱仪：配有紫外检测器；色谱柱：C₁₈反相柱；旋涡混合器；溶剂过滤器；天平。

(三)测定步骤

1．样品制备

称取样品5g(准确至0.1mg)于50mL具塞比色管中，加10.0mL甲醇，在旋涡混合器上混匀1 min，静置5 min，加50％碘化钾水溶液5.0mL，在涡旋混合器上混匀1 min，放置10min。加水至50.0mL，混匀，静置，吸取上层清液通过0. 22um滤膜，滤液置于样品瓶中备用。

2.准曲线的制备

准确移取苯甲酸标准储备液0、0.625、1.25、2.50、5.00、10.00、12.50、25.00mL分别置于8个25 mL容量瓶中，分别加甲醇至25.0mL，配成浓度分别为0、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0、500.0、1000.0ug/mL的苯甲酸标准系列溶液。

分别称取8份5g(精确至0.1 mg)不含苯甲酸和过氧化苯甲酰的小麦粉于8支50mL具塞比色管中，分别准确加入苯甲酸标准系列溶液10.00mL，其余操作同“1．样品制备”中“在旋涡混合器上混匀1 min”以下叙述。标准液的最终浓度分别为：0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、100.0、200.0ug/mL。依次取不同浓度的苯甲酸标准液10.0uL，注入液相色谱仪，以苯甲酸峰面积为纵坐标，以苯甲酸浓度为横坐标，绘制标准曲线。

3．色谱参考条件

色谱柱：4.6mm×250mm, C₁₈反相柱(5um)(为了延长柱子寿命，建议加C₁₈ 保护柱)；检测波长：230nm；流动相：甲醇：水(含0.02mol/L乙酸铵)为10:90(体积分数)；流速：1.0mL/min；进样量：10.0uL。

4．测定

取10.0uL样品溶液注入液相色谱仪，根据苯甲酸的峰面积从工作曲线上查取对应的苯甲酸浓度，并计算样品中过氧化苯甲酰的含量。

(四)结果计算

式中X—样品中过氧化苯甲酚的含量，g/kg;

P—由工作曲线上查出的样品测定液中相当于苯甲酸的浓度，ug/mL;

V—样品提取液的体积，mL;

m—样品质量，g；

0.992—由苯甲酸换算成过氧化苯甲酰的换算系数：242.2/(2×122.1)。

结果保留两位有效数字。小麦粉中过氧化苯甲酰的含量在0.00～0.20mg/kg范围。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过重复性限(r)，本方法的重复性限计算

r=4.7964+0.0594x(x—两次测定值的平均值，mg/kg)。

如果差值超过重复性限，应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定。

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文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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