1．原理

试样中的抗坏血酸用偏磷酸溶解超声提取后，以离子对试剂为流动相，经反相色谱柱分离，其中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸直接用配有紫外检测器的液相色谱仪(波长245nm)测定；试样中的L(+)-脱氢抗坏血酸经L-半胱氨酸溶液进行还原后，用紫外检测器(波长245nm)测定L(+)-抗坏血酸总量，或减去原样品中测得的L(+)-抗坏血酸含量而获得L(+)-脱氢抗坏血酸的含量。以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。

2．试剂与设备

(1)试剂偏磷酸(HPO₃)_n：含量(以HPO₃计)≥38% ,磷酸三钠(Na₃PO₄·12H₂O),磷酸二氢钾(KH₂PO₄) ,磷酸(H₃PO₄) ; 85%, L-半胱氨酸(C₃H₇NO₂S)：优级纯，十六烷基三甲基溴化铵(C₁₉H₄₂BrN)：色谱纯，甲醇(CH₃OH)：色谱纯。

(2)试剂配制偏磷酸溶液(200g/L)：称取2008(精确至0.1g)偏磷酸，溶于水并稀释至1L，此溶液于4℃的环境下可保存一个月；

偏磷酸溶液(20g/L)：量取50mL 200g/L偏磷酸溶液，用水稀释至500mL;

磷酸三钠溶液(100g/L)：称取100g(精确至0.1g)磷酸三钠，溶于水并稀释至1L,

L-半胱氨酸溶液(40g/L)：称取4g L-半胱氨酸，溶于水并稀释至100mL，临用时配制。

(3)标准品L(+)-抗坏血酸标准品(C₆H₈O₆)：纯度≥99%, D(+)-抗坏血酸(异抗坏血酸)标准品(C₆H₈O₆)：纯度≥99%。

(4)标准溶液配制L(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL)：准确称取L(+)-抗坏血酸标准品0.0lg(精确至0.01mg)，用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。

D(+)-抗坏血酸标准贮备溶液(1.000mg/mL )：准确称取D(+)-抗坏血酸标准品0.01g(精确至0.01mg)，用20g/L的偏磷酸溶液定容至10mL。该贮备液在2～8℃避光条件下可保存一周。

(5)设备液相色谱仪：配有二极管阵列检测器或紫外检测器，pH计：精度为0.01,天平：感量为0.1g,1mg,0.01mg，超声波清洗器，离心机：转速≥4000r/min，均质机，滤膜：0.45 um水相膜，振荡器。

3.检测步骤

整个检测过程尽可能在避光条件下进行。

(l)试样制备液体或固体粉末样品：混合均匀后，应立即用于检测。水果、蔬菜及其制品或其他固体样品：取100 g左右样品加入等质量20g/L的偏磷酸溶液，经均质机均质并混合均匀后，应立即测定。

(2)试样溶液的制备称取相对于样品约0.5～2g(精确至0. 001g)混合均匀的固体试样或匀浆试样，或吸取2～10mL液体试样[使所取试样含L(+)-抗坏血酸约0.03～6mg]于50 mL烧杯中，用20g/L的偏磷酸溶液将试样转移至50mL容量瓶中，振摇溶解并定容。摇匀，全部转移至50 mL离心管中，超声提取5 min后，于4000r/min离心5 min，取上清液过0.45 um水相滤膜，滤液待测[由此试液可同时分别测定试样中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的含量] 。

(3)试样溶液的还原准确吸取20 mL 上述离心后的上清液于50mL离心管中，加入10mL 40g/L的L-半胱氨酸溶液，用100g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.0～7.2，以200次/min振荡5 min。再用磷酸调节pH至2.5～2.8，用水将试液全部转移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度。混匀后取此试液过0.45 um水相滤膜后待测[由此试液可测定试样中包括脱氢型的L(+)-抗坏血酸总量]。

若试样含有增稠剂，可准确吸取4mL经L-半胱氨酸溶液还原的试液，再准确加入1mL甲醇，混匀后过0.45um滤膜后待测。

(4)仪器参考条件色谱柱：C₁₈ 柱，柱长250 mm，内径4.6mm，粒径5um，或同等性能的色谱柱。

检测器：二极管阵列检测器或紫外检测器。

流动相：A : 6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵，用水溶解并定容至1L(用磷酸调pH至2.5～2.8)

B：100％甲醇。按A：B =98：2混合，过0.45um滤膜，超声脱气。

流速：0.7mL/min；检测波长：245 nm；柱温：25℃；进样量：20uL。

(5)标准曲线制作分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液进行测定，以L(+)-抗坏血酸(或D(+)-抗坏血酸)标准溶液的质量浓度(ug/mL)为横坐标，L(+)-抗坏血酸(或D(+)-抗坏血酸)的峰高或峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

(6)试样溶液的测定对试样溶液进行测定，根据标准曲线得到测定液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸] 的浓度(ug/mL)。

(7)空白试验空白试验系指除不加试样外，采用完全相同的检测步骤、试剂和用量，进行平行操作。

4.结果计算

试样中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的含量和L(+)-抗坏血酸总量以毫克每百克表示，按下式计算：

式中X—试样中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸、L(+)-抗坏血酸总量]的含量，mg/10g;

P₁—样液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的质量浓度，ug/mL;

P₂—样品空白液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的质量浓度，ug/mL ;

V—试样的最后定容体积，mL;

m—实际检测试样质量，g;

1000—换算系数(由ug/mL换算成mg/mL的换算因子)；

F—稀释倍数(若使用“试样溶液的还原”步骤时，即为2.5)；

K—若使用“试样溶液的还原”中甲醇沉淀步骤时，即为1.25;

100—换算系数(由mg/g换算成mg/100g的换算因子)。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

5．说明

固体样品取样量为2g时，L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出限均为0.5 mg/100g，定量限均为2.0mg/100g。液体样品取样量为10g(或10mL)时，L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出限均为0.1mg/100g(或0.1mg/l00mL)，定量限均为0.4mg/100g(或0.4mg/l00mL)。

文章来源：《食品质量与安全检测技术》

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