4．关于HPLC联用技术

联用技术的迅速发展是当前国际上分析仪器及其应用发展的热门话题之一。很多工作，某一种技术解决不了，但是两种或多种技术联用就解决了。例如，单纯一台薄层扫描仪器或单纯一台拉曼光谱仪器都不能解决的问题，二者联用(薄层扫描仪起分离作用，拉曼光谱仪起检测作用)，问题就很容易解决了。又如，FIA与AAS联用，可以组成As形态分析仪，可以对三价砷(无机、剧毒)和五价砷(有机，无毒或毒性很小)进行分析，在疾控、食品、环境监测等领域非常有用；ICP-MS，LC-MS，GC-MS等均系如此。它们是利用色谱柱的分离效力和质谱的高灵敏度，组成一个检测系统，在食品、药品、生命科学、农业、环境等领域使用非常广泛。所以，联用技术发展，在集成创新方面将有广阔的前景。

HPLC使用者，经常把光谱仪器或其他与HPLC联用的仪器称为检测器，片面强调泵、柱的作用，而忽视作为检测器的仪器。而光谱仪器或与HPLC联用的那些仪器的科技工作者，又往往片面强调自己仪器的重要性，认为色谱泵和柱，只是分离手段之一，只是一种分离附件。其实上述两种看法都不全面，都是片面的。正确的认识应该是，每个部分都是重要的，都是解决分析问题的必不可少的部分。

目前，与HPLC联用的仪器中，质谱仪器最引人瞩目。它是一种质量型的检测器，具有非选择性，并且灵敏度高。它在复杂体系的分析检测、质量控制等工作中被广泛使用，是值得重视的联用技术之一。

5. HPLC的光学类检测器主要技术指标的测试方法

(1)对HPLC光学类检测器的基本要求如下。

①波长范围宽，可更加广泛地适用各种分析检测的要求；

②波长准确度高，因为不同的波长有不同的摩尔吸光系数(ε)，就有不同的灵敏度；

③光谱带宽可调，每一种样品都有自己的最佳光谱带宽，只有在最佳光谱带宽下测试，才能得到最佳结果(最准确的数据)；④杂散光小，因为杂散光是影响比尔定律偏离(分析误差)的主要因素；

⑤漂移小，它是影响检测器可靠性的主要性能技术指标，也是稳定性的主要内容之一；

⑥噪声小，它是限制HPLC整机系统的灵敏度(限制检测下限)的主要性能技术指标，它对使用环境要求低，能够适应在不同的环境下工作；

⑦性价比高，检测器的性能优异，但是价格合理。

(2)目前，国内外光学类HPLC检测器的主要性能技术指标方面存在的问题。如上所述，HPLC光学类检测器的主要性能技术指标有波长范围、波长准确度、波长重复性、光谱带宽、杂散光、噪声、漂移、检测限等。但是，目前国内外大多数HPLC的生产者和使用者，不从仪器学角度和实际使用的要求来认真讨论和测试HPLC的光学类检测器的主要性能指标。并且，不考虑波长范围、光谱带宽、杂散光等指标对适用性和对分析误差的影响，导致在HPLC的光学类检测器的质量上普遍存在很多不符合仪器学理论和使用者要求的地方，严重影响检测器的质量，甚至出现虚假指标。这些问题，都将影响HPLC光学类检测器质量的进一步提高。

(3) HPLC光学类检测器的测试方法(以UVD为例，可以广泛适用)。目前国际上HPLC的检测器约有40多种，其中光学类检测器约有30多种，而光学类检测器中，UVD的使用覆盖面达到75％以上。本节以UVD的主要性能技术指标及其测试方法为例进行讨论，但是该测试方法可以广泛适用于HPLC的其他光学类检测器。

目前，国际上生产HPLC的厂商很多，无一不带UVD。中国也有近20家生产HPLC的企业，基本上都带UVD。并且有的HPLC只有UVD一种检测器，而无其他检测器。但是，目前国内外许多制造商在HPLC的UVD的主要技术指标测试方面还存在许多问题，主要的问题是对HPLC的UVD的主要技术指标的物理概念尚未搞清楚，这些指标对分析结果的误差有多大影响未搞清楚，这些指标的测试方法没有搞清楚。所以，目前国内外对HPLC的UVD的主要技术指标测试方法很不统一。作者在从事HPLC的UVD仪器研发和应用研究的过程中，对其主要技术指标及其测试方法进行了较深入的研究。本节将根据仪器学理论，结合作者的实践，从设计、使用的角度，对HPLC的UVD的主要性能技术指标，提出简易可行的测试方法。

①波长范围及其测试方法。波长范围是指能保证使用时S/N≥2的长波到短波的区间叫波长范围。它直接影响仪器的使用范围。

测试方法：用汞灯(原上海亚明灯泡厂生产的GGQ80，去壳)的一、二级光谱测试。开机预热30分钟后，从长波向短波扫描，找出S/N≥2的范围即是波长范围(根据国际上通用的S/N≥2的标准来判断)。紫外区的波长下限也可以用As灯(193.7nm)来检测(判断根据也是S/N≥2)，但是As灯没有GGQ80的谱线丰富。

②波长准确度及其测试方法。波长准确度是指实际测量波长的值与理论值的符合程度。波长不准会直接影响分析误差。

测试方法：波长准确度非常重要，国内外很多科技工作者对它的测试方法开展了研究。但是，目前不大统一。作者深入地研究过HPLC紫外、荧光检测器的波长准确度的测试方法。现将目前国内外科技工作者对HPLC光学类检测器的波长准确度的多种测试方法归纳如下。

a．采用中压或高压汞灯(作者采用国产原上海亚明灯泡厂生产的GGQ80仪用高压汞灯，去掉玻璃外壳后直接使用)，对HPLC紫外、荧光检测器(带有单色器)的253.7nm、313.0nm、365.0nm、404.7nm、435.8nm、546.1nm、577.0nm、579.0nm等波长处的波长准确度进行测试，效果非常好。因为GGQ80具有80W的功率(交流220V电压供电)，再加上去掉了玻璃外壳，所以只要将去壳的GGQ80汞灯放在仪器的原光源位置(不需要作任何调节)，从长波向短波扫描，就可以很方便地测试出253.7～579.0nm波段的波长准确度。此方法非常方便、适用，作者经常采用此方法，都得到了满意的结果。

b．仪器的紫外区采用低压汞灯的253.7nm或中压汞灯的365.0nm测试；在可见区采中压汞灯的435.8nm或546.1nm测试；在可见区也可采用氘灯的656.1nm特征谱线测试。此种方法适用性较强，对硅光电池、光电管、光电倍增管等做光接收器的HPLC紫外、荧光等检测器都适用。这种方法已被很多科技工作者采用。

c．如果仪器是使用本身具有很大的放大倍数的光电倍增管做光接收器，则可以用一只低压汞灯(笔型，如HG20型)，从600～250nm扫描，就可以得到253.7nm、313.0nm、365.0nm、404.7nm、435.8nm、546.1nm、577.0nm、579.0nm等波长处的波长准确度。作者经常采用此方法，都得到了满意的结果。

d．如果液相色谱仪器用硅光电池做光接收器，并且波长准确度要求不高(1nm左右)，这时也可以用低压汞灯的253. 7nm+氘灯的486.0nm、656.1nm特征谱线进行波长准确度测试。具体做法也可以先测试低压汞灯的253.7nm(低压汞灯放在仪器原光源的位置，不需要做任何调节就可以进行测试)，再测试仪器原有氘灯的486.0nm、656.1nm。此方法简单、适用，对操作者要求不高。目前，国内有些液相色谱仪器的厂商就是采用这种方法，效果令人满意。

e．如果HPLC检测器的光接收器是光电倍增管，可以用一只低压汞灯或一只中压汞灯来测试波长准确度。具体操作是对汞灯(低压汞灯或中压汞灯)从长波向短波扫描，而后，每条特征谱线(579.0nm、577.0nm、546.1nm、435.8nm、 404.7nm、365.0nm、313.0nm、253.7nm)的理论值与实际测量值相减，就是波长准确度。此种方法使用也很广泛。

上述5种测试方法的具体操作、数据处理方法如下：对有关的灯的每条谱线各实测至少3次或5次(或扫描3～5次)。用各次实际测试波长值与理论值之差中的最大值(最差者)表示该波长的波长准确度，但数字前面一定要加“±”符号(我国计量检定规程，也是与国际接轨的做法)。最后，选取各点中最差的那个点，作为整机的波长准确度。此种数据处理方法比较严格，作者认为应该如此。

也可对3次或5次实际测量波长值取均值，用均值与实践测量值之差中最大(最差)者，再与理论值(汞灯和氘灯特征谱线的实际值)之差来表示波长准确度(据美国NBS和ASTM标准判断)。此种方法容易低估仪器的波长准确度。

f．目前，也有科技工作者采用重铬酸钾作为波长准确度的测试物质(我国国家液相色谱仪器的计量检定规程JJG705-2002就是如此规定的)。其具体做法是：扫描重铬酸钾，在重铬酸钾的连续光谱图上的几个已知的连续波峰值位置，寻找相应的波长实测值，然后将重铬酸钾的已知值与实际测量值相减，其差值就是仪器的波长准确度。作者认为此种方法不可采用。因为波长准确度测试时，要求用具有理论值的线光源；并且，各线相邻20nm内没有谱线。而此方法用连续光源(氘灯)，利用重铬酸钾的吸收峰来判断波长位置。重铬酸钾没有尖锐的吸收线，它是一个吸收带，因此，不可能找到需要测试的波长的相应峰值位置。如果说找到了，那只是估计值，很不准确。这种方法既不科学，又不与国际接轨，因此作者建议不能采用。

③波长重复性及其测试方法。波长重复性是指多次波长准确度测试值中的最大值与最小值之差。它直接影响仪器的稳定性。

④波长重复性的测试与数据处理方法。在上述的各方法中，每种方法的3次或5次测试中，取最大测试值与最小测试值之差，就是波长重复性。也有科技工作者，用取每种方法的3次或5次测试中的平均值，与各次测试值中的最大值或最小值之差中的最差者，作为波长重复性(据美国NBS和ASTM标准判断)。作者认为前者较好，比较严谨。

⑤光谱带宽(分辨率)及其测试方法。光谱带宽是指HPLC检测器的单色仪，出射狭缝谱面上单位长度上的光谱数。最小光谱带宽一般可表征检测器的光学分辨率。

测试方法：用“谱线轮廓法”测试，一般应该用汞灯的253.7nm这条特征谱线来检测。具体方法是对253.7nm谱线扫描，取其半高度处的宽度作为光谱带宽。检测氘灯的特征线656.1nm(或汞灯的特征线546.1nm或其他元素灯)，用测试253.7nm的方法也可以测定光谱带宽。测试中，每灯的各条特征线各实测3次，取均值即是(美国NBS标准)。

对于HPLC光学类检测器的光谱带宽(光学分辨率)测试方法中，有些科技工作者主张用苯蒸气测试，因为苯蒸气在260nm附近有三个吸收峰，他们就用这三个峰的峰谷之间的差值来表示分辨率。作者认为这是很不妥当的。为什么不妥？因为，表征分辨率的与国际接轨的方法是用光谱带宽，并且一定要有量纲(nm)；但是苯蒸气的这三个峰和谷的差值是一个比值，它既没有量纲，又没有达到或符合瑞利准则要求。还有一个特别要重视的问题，这就是苯有毒，对人体的肝脏有伤害，国际上早就废除了这种方法。至于仪器的色谱分辨率，主要是通过测试分离柱的柱效得到。但是，分离柱的柱效一般是色谱柱生产商应该给出的。一根色谱柱，到了使用者手里，即使测试出柱效很不好，也无法改变了。

作者认为，用于HPLC仪器的色谱分辨率是用户主要要考虑的问题，而光学分辨率对HPLC仪器来讲意义不大。但是，这对能停泵扫描的HPLC仪器还是有重要意义的。

⑥杂散光及其测试方法。杂散光是指测A时，仪器中不应该有光的地方有光。它是被分析样品浓度上限的分析误差的主要来源之一。它直接限制仪器的检测上限(偏离比尔定律)。

测试方法：冷态开机，预热30分钟，SBW=2nm(固定光谱带宽的仪器不需要设置)，用标准液NaI和NaNO2充满流动池；分别测试220nm、340nm处的杂散光。各实测3次，取均值即是所测试的检测器的杂散光[中国国家标准(GB)，国际上均如此]。

也可用He-Ne Laser(标准光源)测试。具体做法：在632.8±5nm处测试。实测3次，取均值即是(法国JY标准)。

⑦噪声和漂移的测试方法。噪声是指检测器无规则的输出。它是被测样品浓度下限的主要分析误差的来源，直接限制检测器被分析样品浓度的下限。

测试方法：冷态开机(一般指关机2小时后开机)，预热30分钟，连续测试1小时；在这1小时里任取10分钟，测其10分钟里的最大值与最小值之差；取1小时里无数个10分钟里最差的10分钟的最大值与最小值之差。

漂移的定义和测试方法：噪声测试中的1小时里最大值与最小值之差，就是漂移。

相关链接：HPLC检测器的发展现状及其进展（三）