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一、高压输液系统
高压输液系统除了主要部件高压泵之外,还包括一些辅助的装置,如流动相贮液槽、脱气装置、梯度洗脱(gradient elution)装置等。为了除去流动相中溶解的气体(O2和N2),贮液槽通常带有使用真空泵的脱气装置。梯度洗脱装置的作用是让流动相的组成随时间而改变,以调节流动相的极性、离子强度或pH值,使试样组分的相对保留值得以改变,从而提高分离效率。梯度洗脱有两种方式:一种称低压梯度,指常压下溶剂按一定比例混合后再由高压泵输入色谱柱,又称外梯度;另一种称高压梯度,指先用高压泵将各溶剂输入混合器混合,再送人色谱柱,也称为内梯度。
高压泵的输出压力一般在150~500kg/cm2。(1kg/cm2=98.0665kPa),流速在0.01~10m1/min。对高压泵的要求是流速恒定,无脉动,流量可以调节。常用的高压泵有往复泵,柱塞往复运动,由单向阀控制吸液、排液,输出液体压力和流速具有一定脉冲,一般采用双泵或多泵系统,并加阻尼装置,以提高输出压力和流速的稳定性。此外柱塞泵往复运动频率高,对泵的密封、结构、材料、加工等都有特殊要求。
二、进样系统
进样系统是将待分析样品引入色谱柱的装置。进样装置需满足重复性好、死体积小、在柱的中心进样、进样时对色谱柱系统流量波动要小,便于实现自动化等多项要求。进样系统包括取样、进样两种功能,实现这两个功能又有手动和自动两种方式。
1.注射器进样装置
注射器进样装置是指使用注射器,刺穿弹性隔膜后柱头直接进样;这种进样方式适用于较低压力,在现代HPLC操作中已不用。
2.阀进样装置
阀进样装置适用于高压进样。阀进样装置由高压六通阀和固定体积的定量管组成。阀体用不锈钢制成,内壁精密加工,旋转密封部分由既耐磨又具有良好的密封性能的铝合金陶瓷材料或聚四氟乙烯制作。进样时在定量管里充满试样,然后通过切换阀进样。进样量大小可通过选择不同体积(1~103μl)定量管来改变。
3.自动进样器
自动进样器在程序控制器或微机控制下可自动完成取样、进样、清洗等一系列操作,操作中需将样品按顺序装入贮样装置即可。
4.进样技术对峰扩展的影响
进样技术对峰扩展的影响包括进样体积、进样时间、样品浓度、选用的进样装置、进样方式和进样位置。进样体积过大会使柱效下降,峰形变宽。进样时间越短越好。但较难控制。样品浓度易使柱头瞬间饱和,造成谱峰严重展宽,分离度下降。柱头超载不仅与固定相有关,而且与溶质及溶剂的性质有关。一般认为,在柱容量范围内,注入较大体积稀溶液优于较小体积的浓溶液,即样品浓度对谱峰展宽的影响比样品体积更为重要。
由于HPLC柱要比气相色谱柱短得多,所以因进样系统和检测器中存在的死体积所引起谱峰展宽的影响要大得多。为了克服柱头展宽,HPLC法对进样要求较为严格。无论哪一种进样,都要求做到准确进样、重现性好。
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