一、茨维特的经典实验

茨维特的经典实验(图8-1)是使用一根填充白色菊粉的玻璃柱管来分离植物叶的石油醚提取液，实现了不同色素的分离。

图8-1茨维特吸附色谱分离实验示意图

1-装有白色菊粉[inulin, (C₆H₁₀O₅)_n]的色谱柱；2-装有石油醚的漏斗；3-接收洗脱液的锥形瓶；4-色谱柱顶端石油醚层；5-绿色叶绿素；6-黄色叶黄素；7-黄色胡萝卜素；8-色谱柱出口填充的棉花

操作时将植物叶的石油醚提取液倒入菊粉柱中，提取液中的色素被吸附在柱的顶端，然后用纯净的石油醚不断冲洗，与此同时可观察到柱管从上到下形成绿、黄、黄三个色带。再继续用石油醚冲洗，就可分别收集各个色带的洗脱液，经鉴定后其分别为叶绿素、叶黄素和胡萝卜素。茨维特在他的原始论文中，把上述分离方法叫作色谱法，把填充菊粉的玻璃柱管叫色谱柱，把柱中出现的有颜色的色带叫色谱图。现在的色谱分析已经失去颜色的含意，只是沿用色谱这个名词。

由茨维特经典实验可以看到，色谱分析法是一种物理的分离方法，其分离原理是将被分离的组分在两相间进行分布，其中一相是具有大表面积的固定相菊粉，另一相是推动被分离的组分(色素)流过固定相的惰性流体(乙醚)，叫流动相。当流动相载带被分离的组分经过固定相时，利用固定相与被分离的各组分产生的吸附(或分配)作用的差别，被分离的各组分在固定相中的滞留时间不同，使不同的组分按一定的先后顺序从固定相中被流动相洗脱出来，从而实现不同组分的分离。

二、色谱分析法的分离原理及特点

实现色谱分离的先决条件是必须具备固定相和流动相。固定相可以是一种固体吸附剂或为涂渍于惰性载体表面上的液态薄膜，此液膜可称作固定液。流动相可以是具有惰性的气体、液体或超临界流体，其应与固定相和被分离的组分无特殊的相互作用(若流动相为液体或超临界流体，可与被分离的组分存在相互作用)。

色谱分离能够实现的内因是由于固定相与被分离的各组分发生的吸附(或分配)作用的差别。其宏观表现为吸附(或分配)系数的差别，其微观解释就是分子间相互作用力(取向力、诱导力、色散力、氢键力、络合作用力)的差别。

实现色谱分离的外因是由于流动相的不间断的流动。由于流动相的流动使被分离的组分与固定相发生反复多次(达几百、几千次)的吸附(或溶解)、解吸(或挥发)过程，这样就使那些在同一固定相上吸附(或分配)系数只有微小差别的组分，在固定相上的移动速度产生了很大的差别，从而达到了各个组分的完全分离(图8-2)。

此外，色谱分析法具有物理分离方法的一般优点，即进行操作时不会损失混合物中的各个组分，不改变原有组分的存在形态也不生成新的物质。因此若用色谱法分离出某一物质，则此物质必存在于原始样品之中。

图8-2色谱分离过程示意图

(a)向色谱柱注入样品组分A、B；(b)样品组分A、B在固定相和流动相进行竞争分配；(c)样品组分A、B在固定相和流动相发生反复多次的竞争分配；(d)在色谱柱中滞留时间短的A组分先到达色谱柱末端，滞留时间长的B组分仅到达色谱柱的中部

三、色谱分离过程的平衡常数

色谱分离过程的平衡常数可用吸附系数K_A、分配系数K_p和分配比k定量地表述。

吸附系数K_A

在一定柱温和色谱柱的平均压力下，m表示1cm₂吸附剂吸附组分的量，g/ cm²；V_w表示1mL流动相中所含组分的量，g/mL。

分配系数Kp

在一定柱温和色谱柱平均压力下，c_s和c_M分别为样品组分在单位体积固定液和单位体积流动相中的浓度，mol/L。
分配比(或称容量因子)k:

式中，V_s和V_M分别为柱温、柱平均压力下，色谱柱中固定相和流动相所占有的体积；填充色谱柱内流动相与固定相的体积比叫相比，用β表示，

四、色谱分析法的分类

色谱分析法的分类通常有如下三种方法：按照固定相和流动相的状态分类(表8-1)；按照固定相性质和操作方式分类(表8-2)；按照色谱分离过程的物理化学原理分类飞表8-3)。

表8-1按两相状态分的色谱法分类

表8-2按固定相性质和操作方式分的色谱法分类

表8-3按分离过程的物理化学原理分的色谱法分类