某些物质经一定波长光照射(或者吸收电磁辐射)后会受到激发，被激发的分子或者原子从激发态返回到基态(去激发)时，会发射出波长比入射光长的不同强度的光，而当照射(或者辐射)停止后，发射光也随即消失，这种再发射的光称为荧光。荧光现象是由西班牙医生和植物学家N. Monardes在1575年第一次发现并记录的。后来科研人员陆续发现一些发荧光的材料和溶液，到19世纪末，人们已经知道了600种以上能发荧光的化合物。这期间，科研人员逐步认识到从激发态回跳到基态的发射光波长比吸收的或者入射的光稍长。20世纪以来，荧光现象得到较为广泛的研究，例如，共振荧光和增感荧光的发现、荧光的定量分析、荧光产率的测定以及荧光寿命的直接测定等^[1]。

荧光分析法的发展与仪器设备的应用发展密切相关。第一台光电荧光计出现在1928年，当时的仪器灵敏度有限。直到1939年光电倍增管出现，仪器灵敏度和分辨率得到大幅增加，该发明也对分析和测试性能更高的单色仪的发展起到了至关重要的作用。后来，经过仪器的不断更新和发展，1952年出现了商用的校正光谱仪器^[1]。荧光光谱分析既可以进行定性检测也可进行定量测定，同时还能够作为一种先进分析技术研究体系的物化性质及其变化情况。

通常具有刚性平面结构和大共轭体系的化合物具有能发射荧光的内在本质，这样的物质被称为荧光化合物。人们利用荧光化合物可以进行如下科学研究：①利用研究体系自身含有荧光团而具有的内源荧光，通过检测其荧光特性参数的变化，可对该体系的某些性质加以研究；②如果研究体系本身不含有荧光团，即不具有内源荧光，或者所含的内源荧光较弱，就可以通过外加荧光化合物作为荧光探针，通过测量荧光探针的特性变化来间接地对该体系进行研究。例如，可以将对极性敏感的荧光探针加入到待测体系中，通过对荧光探针的荧光性质的检测，或通过其荧光特性的变化来测试体系的极性变化。

荧光分析法的优点之一是灵敏度很高，其灵敏度一般要比其他微量分析法高2～3个数量级。荧光分析的灵敏度可达亿分之几，在与其他技术联用时，荧光检测能够接近或达到单分子检测的水平。荧光分析法还有选择性高的优点，尤其体现在对有机物的分析检测方面。因为结构有差异，所以并非所有的有机物都有荧光，能发荧光的物质的激发和发射波长也存在差异。因此，选择适当的激发波长或者发射波长作为检测波长，可以实现选择性检测目的。或者通过考察其他的荧光特性参数，如量子产率、荧光寿命、荧光偏振等来进一步进行分析测定。这些可以借助选择不同的测试技术如同步扫描、导数光谱、三维光谱、相分辨和时间分辨等进一步提高测定的选择性。此外，用量少、方法简单、线性范围宽、重复性好、操作简单也是荧光光谱分析的优点。

随着学科的交叉和各学科的迅速发展，纳米材料和技术、激光等光学、电子学和微电子器件等新技术的引入，荧光分析法在理论和应用方面得到了很大程度上的进展，催生了一些新的荧光侧试技术和方法，如荧光免疫侧定、倒数荧光测定、同步荧光测定、荧光偏振测定、相分辨荧光侧定、时间分辨荧光测定、固体表面荧光测定、低温荧光测定、三维荧光光谱技术、近红外荧光分析法、荧光反应速率法、空间分辨荧光技术、荧光显微与成像技术、荧光探针技术、单分子荧光检测技术等。荧光光谱测试方法的应用涉及化工、农业、材料科学、环境科学、生命科学、食品科学和公安情报等诸多领域。荧光光谱分析法已经发展成为一种重要且有效的光谱化学分析手段。

基本原理

稳态荧光光谱分析的两种基本图谱是激发光谱和发射光谱。激发光谱(Ex)是记录固定的荧光发射波长下，不断变化的激发光波长与测得的荧光强度的关系图谱；而记录在固定的激发波长下不断变化的发射波长与荧光强度的关系图谱，即是发射光谱(Em)。这两种光谱均可用来鉴别荧光化合物，还可作为进行荧光测定时选择合适的激发波长和发射波长的直接依据。根据发射光波所处的波段范围，可将荧光分成X射线荧光、紫外荧光、可见荧光和红外荧光等。

因为荧光仪器个体差异和各自的特性(如光源的能量分布、检测器的敏感度和单色器的透射率都会随波长而改变)不同，一般情况下测得的激发光谱和发射光谱都是表观光谱。也就是说，同一荧光物质的溶液在不同荧光仪器上所测得的两个表观光谱往往会有一定程度的差异。但是对所用仪器特性波长因素加以适当校正后，可以获得彼此一致的校正光谱(又称真实光谱)。对于同一种荧光化合物，其激发光谱的形状在理论上应与吸收光谱的相同，但是由于上述测试仪器的特性波长因素存在，其表观激发光谱与吸收光谱的形状大多有所差异，只有校正激发光谱才与吸收光谱接近。另外，只有当化合物的浓度足够小，其对不同波长的入射光的吸收正比于其吸光系数，而且其荧光量子产率与激发波长无关的条件下，所得的校正激发光谱与吸收光谱的形状才相同。

通常物质吸收光谱会因为复杂的分子结构含有多个不同的吸收谱带，但是其荧光的发射光谱一般只含一个发射谱带。从能量和能级结构关系图上看，物质分子受到电磁辐射后，其电子会从基态跳跃(激发)到多个电子单重态的不同振动能级，进而产生多个吸收谱带，该跃迁过程的经历时间大约是10^-15s；处于激发单重态的电子不稳定，寿命很短。在回跳到基态的过程中，因为存在变化速率极快的内转化和振动松弛等现象，处于S₂单重态以上各振动能级的电子会很快损失多余的能量，衰变到S₁态的最低激发振动能级，最后回跳到基态的各个振动能层，发射出荧光。因此，只要激发光没有导致化合物光解，无论激发波长是多少，多数情况下同一物质的分子发射光谱只含一个发射带，并且荧光发射光谱的形状通常是一致的。发射光谱的形状只与分子基态中振动能级的分布情况以及各振动能级的跃迁概率有关。当然也有例外，例如有些荧光化合物有两个电离态，而每个电离态就会显示出不同的吸收和发射光谱^[1,2]。

荧光化合物的发光本质是电子的激发跃迁和回跳到基态的过程中能量变化的反映。当一定波长的激发光照射到化合物上，分子的电子因吸收能量而从较低的能级跃迁到较高的振动能级，两个能级的能量差等于所吸收光子的能量。位于激发态的分子称为电子激发态分子。通常用作荧光分析的入射光必须具有较高的、足够引起分子电子发生能级间跃迁的光子能量，可以是紫外或者可见光。通常用2S+1表示电子激发态的多重态，S是电子自旋角动量量子数的代数和，取值为0或1。根据电子填充规则，只有自旋方向相反的两个电子才能占据同一能级轨道。根据电子填充情况将分子的状态分为单重态和三重态两种状态。如果分子内全部电子均处于自旋配对(S=0)，则该分子处于单重态(或称单线态)，用符号S表示；如果分子具有两个自旋不配对的电子，即S=1，那么分子便具有激发的三重态(或称三线态)，用符号T表示。通常情况下，多数有机物分子的基态都是单重态。如果吸收能量后分子电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，此刻分子仍处于单重态的状态，为激发单重态。然而如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，此时分子具有两个自旋不配对的电子，即处于激发的三重态(T)。通常用S₀、S₁和S₂分别表示分子的基态、第一和第二电子激发单重态，用T₁和T₂分别表示第一和第二电子激发三重态。处于激发态的分子活跃度极高，不稳定，因此会通过快速的辐射和非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。此外，处于激发态的分子也可能由于分子间的相互作用而失活。荧光或者磷光就是伴随着激发电子的辐射跃迁衰变产生的光子发射。非辐射跃迁的衰变结果是导致激发能转化为热能传递给周围的介质，其过程包括内转化(ic)、外转化(ec)、振动松弛( VR)和系间窜越(isc)。内转化是指相同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过程，常发生在非常靠近的两个电子能级的振动能级有重叠时(如S→S₀, T₂→T₁)；外转化是指激发分子与溶剂分子的相互作用及能量转移，使荧光或者磷光强度减弱甚至消失；振动松弛是指分子将多余的振动能量传递给介质而衰变到同一电子态的最低振动能级的过程；系间窜越是指不同的多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过程(如S₁→T, T₁→S₀)。图17-1为分子内所发生的电子激发过程以及衰变过程(辐射跃迁和非辐射跃迁)的示意图^[1,2]。

图17-1分子内的电子激发和衰变过程

A₁, A₂-吸收；F荧光；P-磷光；ic-内转化；ec-外转化；isc-系间窜越；VR-振动松弛

如图17-1所示，被激发到S1以上的某个激发单重态的不同振动能级上的电子，很快通过振动松弛而衰变到相同电子态的最低振动能级，又经振动松弛、内转化而衰变到S₁态的最低振动能级。图中所示的衰变到基态的途径有：①辐射跃迁(S→S₀)过程而发射荧光；②内转化S→S₀;③系间窜越S₁→T₁。另外，处于T₁态的最低振动能级的分子，可能会发生T₁→S₀的辐射跃迁，该过程发射的光叫磷光，也可能同时发生T₁→S₀的系间窜越衰变。

荧光发射光谱形状与激发光波长无关，但是荧光的种类与激发光的波长关系密切。根据发射光与激发光波长的关系，可以将荧光分为斯托克斯(Stokes)荧光、反斯托克斯荧光以及共振荧光。荧光的波长比激发光长的叫斯托克斯荧光，比激发光短的叫反斯托克斯荧光，而荧光波长与激发光相等的则是共振荧光。在溶液中观察到的通常是斯托克斯荧光。