一、原生质体培养及植株再生

(一)细胞壁再生

原生质体培养后经过一段时间会再生出细胞壁，原生质体在培养初期仍然为圆球形，随着培养时间的延长，逐渐变为椭圆形，此时表明已经开始再生细胞壁。不同植物原生质体培养再生细胞壁所需时间不同，从几小时到几天。例如，香蕉原生质体培养24h可以再生细胞壁，而梨原生质体细胞壁再生则需要12～13d。研究原生质体再生细胞壁的方法较多，如质壁分离法、冷冻-融化法、低渗冲击法、出芽法、荧光增白剂染色法和SDS溶膜等，其中最为理想的是六胺银染色电镜观察法、扫描电镜法，尤其是冰冻蚀刻法效果最佳。现在常用的一种简单方法是采用荧光增白剂(calcofluor white)，有ST和VBL两种，前者染壁后在荧光显微镜下细胞壁呈蓝色荧光，后者则呈绿色荧光。

原生质体再生细胞壁发生在细胞分裂之前，是细胞分裂的先决条件。在没有细胞壁时，虽然能够看到有丝分裂，但胞质不发生分裂。如果在原生质体培养基中加入一些细胞壁再生抑制剂，发现没有细胞分裂现象发生。

(二)原生质体培养中的粘连现象

在植物原生质体液体培养中，经常观察到原生质体发生自然粘连现象(aggregation) ,这一现象在柑橘、胡萝卜、谷子、荔枝等植物原生质体培养中发生。发生粘连现象并不表明培养基中的原生质体密度特别大，实际上在10⁴～10⁶个／mL均可能观察到粘连现象的发生。发生粘连对有的作物的原生质体具有正面影响，而对有的作物则具抑制作用。例如，在柑橘原生质体中，观察到在容易发生粘连的原生质体培养中，往往是那些发生了粘连的细胞能够正常分裂、生长和再生成植株，而未粘连的原生质体却难以持续分裂。但在荔枝中原生质体粘连则容易导致培养失败。原生质体粘连并不是发生于所有植物的原生质体培养中，如高密度(10⁶个／mL)烟草原生质体培养未观察到粘连现象。李莉等(1995)的研究表明，造成原生质体粘连的根本原因是原生质体表面的负电荷，如果原生质体表面的负电性弱(如胡萝卜和谷子)，则容易出现粘连；相反，表面负电性强的原生质体(如水稻和烟草)不容易发生类似的粘连现象。粘连现象可以通过加入增加表面负电性(如ABA)或减轻表面负电性(如Ca²⁺)的物质得到调节，加入ABA会使粘连减轻，加入Ca²⁺则会使粘连现象得到进一步的加剧。

(三)细胞团形成和植株再生

再生细胞壁之后不久就会恢复第一次分裂，不同植物、不同基因型或不同来源的原生质体恢复第一次分裂的时间不一样，有的只需1～2d(如落叶松)、有的则需要4～7d(如柿、树梅、洋麻、百脉根、柑橘)、有的则需要l0d以上甚至更长时间(如高粱)。具有再生能力的原生质体会不断分裂，形成多细胞团。此时，要注意加入新鲜培养基以适应细胞生长的需要。当细胞团进一步发育成为肉眼可见的小愈伤组织(minicallus)，要及时转移到分化培养基(differentiation medium)中。分化培养基包括胚状体诱导培养基、生芽培养基、生根培养基等。愈伤组织转入分化培养基后，通常会经历两种途径再生成植株，一种是器官发生途径(如水稻、苹果、梨、杨树、悬铃木等)，另一种是体细胞胚胎发生途径(如柑橘、棉花、香蕉)。图6-1是柑橘原生质体分裂、形成细胞团及再生植株的过程。

图6-1柑橘原生质体培养与植株再生过程

A.变椭圆的原生质体；B.第一次分裂；C.多次分裂后；D.肉眼可见的细胞团；E.愈伤组织；F.愈伤组织再生胚状体；G、H.再生从芽和单芽

(四)影响原生质体培养及植株再生的因素

影响植物原生质体培养的因素较多，有原生质体来源、基因型、培养基、原生质体培养程序等。

1．原生质体来源

典型的例子是禾本科植物的原生质体，水稻原生质体培养早期主要是叶片分离的原生质体，但很难培养成功，而采用幼胚或成熟胚诱导的胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系游离原生质体取得了突破。有报道称经低温预处理的外植体分离的大豆原生质体培养10～15d时植板率高达40％，分裂高峰可持续20d左右；而对照植板率只有15％～25％，分裂高峰在第10天前后，之后就下降，并且出现了褐化。分离原生质体所用外植体的生理状态与原生质体的质量和其后的分裂频率有着密切的关系，如在小麦原生质体培养中，3～6月龄的悬浮细胞系分离的原生质体分裂率比1月龄的原生质体高。番茄叶肉原生质体再生的愈伤组织比悬浮系原生质体再生的愈伤组织分化早2个星期。黄瓜胚性悬浮培养物分离的原生质体在4～5d恢复第一次分裂，而愈伤组织原生质体需要7～8d。

2．基因型

研究表明基因型与原生质体培养及形态分化有一定的关系，同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同，造成不同品种在相同条件下的再生能力也会不同。基因型影响原生质体的持续分裂和植株再生的现象已在甜菜、水稻、棉花、柑橘和油菜等作物中观察到。例如，吴家道等(1994)用16个品种的水稻原生质体进行培养，只有3个品种得到再生植株。Hu等(1999)采用饲喂层培养芸薹属及相关属共6个类型，即甘蓝型油菜(Brassica napus),芸薹[B. cam pestris (syn. B. rapa)]、芥菜(B. juncea)、诸葛菜(Orychophragmus violaceus),菘蓝(Isatis indigotica)和新疆野生油菜(Xinjiang wild rape)的36个基因型的原生质体，其中B. campestri、和新疆野生油菜不能再生植株，其他类型均能再生出植株。Olin-Fatih (1996)培养B. campestris, B. oleracea和B. napus的原生质体，其中B. campestris再生的植株最少。Meyer等(2009)培养4个基因型的矮牵牛叶肉原生质体和9个基因型的小花矮牵牛叶肉原生质体，分别有3个和5个基因型得到再生植株。基因组水平也会影响到原生质体再生。例如，不同基因组的芸薹属植物原生质体培养时，AA基因组植物再生能力最低，CC基因组植物再生能力最高，AACC基因组植物的再生能力居中。

3．培养基

即使来源于同一种基因型的原生质体，在不同培养基中的再生能力也不一样。采用MS, V-KM和MS-KM三种培养基培养西红柿的原生质体，在最后一种培养基中的植板率最高。采用DZ、DCR, KM_8p和TE 4种培养基培养火炬松(Pinus taeda L.)的原生质体，在DCR培养基中植板率最高，体细胞胚胎发生反应最强，而在玖和TE培养基中不能形成胚状体。培养基除影响培养效果外，在有的作物原生质体培养中影响到分化类型。例如，许智宏等(1982; 1984)发现在形成细胞团的数量上，KM₅P和KM₅都不如B₅P培养基，但对细胞的持续分裂来说，KM₅P和KM₅又优于B₅P培养基。

培养基中的附加物质也会影响原生质体培养效果，如培养基中的内源激素对原生质体分裂和再生有较大的影响，以烟草试管苗叶、美味猕猴桃、毛花猕猴桃子叶愈伤组织及玉米叶片为材料，进行了内源激素水平的测定和原生质体培养的研究，结果表明，高水平内源玉米素核苷(ZR)和高ZR/IAA值有利于原生质体分裂，但高水平的ABA对原生质体的分裂起着抑制作用。在猕猴桃和葡萄原生质体培养中，同样发现基本培养基中加入NAA和BA能够提高原生质体的分裂频率。油菜小抱子原生质体在无生长激素的培养基中，有14. 5％的原生质体发生了分裂，但只形成出芽状的多细胞结构，只有在添加了2,4-D和NAA的培养基中才能形成小愈伤组织。除激素外，其他成分也会对培养产生影响。水解酪蛋白(ca-sein Hy击。厅sate)可以较大程度上提高紫草原生质体的分裂频率，谷氨酰胺和羟脯氨酸能使水飞蓟原生质体的分裂频率达到35％。柠檬酸能够促进菠菜原生质体分裂。谷胱甘肽能诱导烟草叶肉原生质体去分化，而脱氢抗坏血酸则抑制了原生质体分裂(Potters et al.，2010)。 Wardrop等(1996)在粳稻［Japonica rice (Oryza sativa L.)］品种‘Taipei 309'原生质体培养基中加入氧化全氟(oxygenated perfluorochemical, PFC)液体，可以使植板率增加5倍，苗的再生效率增加12％。Hu等(1999)报道在芸薹属不同类型原生质体再生培养基中加入6umol/L和30umol/L的硝酸银可以将苗的再生频率分别提高到25.4％和52. 2 ％，而对照只有7.3％。加入硝酸银还能诱导没有反应能力(non-responsive)的基因型再生苗。值得提出的是，影响原生质体培养效果的无机盐成分主要是NH⁴⁺，早在1975年有学者发现NH⁴⁺抑制马铃薯原生质体的分裂。之后，又有更多的报道称高浓度的NH⁴⁺对构树、李、杏等植物原生质体培养不利。

4．培养条件和培养方法

培养环境的光质影响原生质体细胞壁再生。例如，在绿豆原生质体培养时，红光培养下的原生质体细胞壁再生率最高，其次为白光，在蓝光中培养的原生质体细胞壁再生比例最低。并且红光和白光对绿豆的第一次分裂有明显的促进作用，蓝光的促进作用小甚至没有。Sun等(1998)发现将B. napus品种‘Topas’原生质体连续培养在32℃而不是25℃中有利于细胞开始分裂和细胞增殖，但不利于植株再生。培养方法不同，其结果也会不一样。例如，在黄花烟草叶肉细胞原生质体培养中，固液双层培养的原生质体比固体培养的原生质体要提前1个星期形成细胞团和愈伤组织。Dovzhenko等(1998)采用藻酸盐凝胶薄层技术培养烟草叶肉原生质体可以高频率、快速获得再生芽，最快的只需要2个星期，采用生根培养基只需10d即可诱导根的形成。尽管认为看护培养可以促进原生质体再生，但看护细胞的类型也影响原生质体再生的效果，如Indica rice品种‘IR36’水稻原生质体只能在Lolium multi f lorum作为看护培养细胞的滤纸膜培养程序中才能再生细胞团，而用野生稻(Oryzaridleyi )和Japonica rice (O. sativa cv. Taipei 309)细胞作为看护培养细胞均不能再生(Tang et al.，2000)。分化培养基是再生植株不可缺少的培养基，然而分化培养基的使用方法可能会影响到植株再生，采用分步分化法(逐步降低生长素浓度或提高细胞分裂素浓度)比单一采用同一分化培养基更容易诱导植株分化，这一现象已在猕猴桃和水稻原生质体培养中观察到，如采用两步培养法获得了最难培养成功的水稻品种‘IR36’的原生质体再生植株。

5．渗透压调节剂

此类物质对原生质体分裂能产生较大的影响，如前所述，渗透压调节剂类型较多，其作用也不一样，主要依赖于所培养的植物类型。在一种植物原生质体培养中起促进作用的调节剂在另一种植物中则不一定能起到相同的作用。李韬等研究了不同类型渗透压调节剂对原生质体细胞分裂频率的影响，如表6-4所示。从表中可以看出，以蔗糖为渗透压调节剂的效果最好，其分裂频率达23. 2％，而以甘露醇为调节剂的分裂频率只有11.4％，甘露醇+葡萄糖的效果居中，为17.7％。蔗糖对枸杞原生质体分裂和细胞团的形成也起到了促进作用。但这并不表明蔗糖就是最好的渗透压调节剂，它在有些植物的原生质体培养中效果不如葡萄糖。例如，在构树、人参、当归、川芎和紫草等药用植物的原生质体培养基中，以蔗糖和果糖作碳源和渗透压稳定剂时，细胞不能持续分裂，而用葡萄糖时，原生质体能持续分裂并形成细胞团。在花椰菜下胚轴原生质体培养中，同样发现用蔗糖作为渗透压稳定剂效果不如葡萄糖。

表6-4不同渗透压调节剂对马铃薯原生质体分裂频率的影响(李韬和戴朝曦，2006)

6．微电流处理

已经发现微电流处理能够促进三叶草、白芷、石防风、梨属、李属、大豆属和茄属植物原生质体细胞壁再生，提高分裂频率，促进细胞团的形成，其原因可能是与植物体自身存在微电流有关，外加微电流可能加强了植物体自身微电流的作用，从而促进细胞的生长。

上述影响因素都是表观原因，深层次、更复杂的机理尚不清楚。近年来，国内外学者应用植物生理、细胞和分子生物学等方法研究其再生机理，在各层次都取得了可喜的成绩。在生理水平上，希腊Roubelakis-Angelakis教授课题组通过比较可再生的烟草叶肉原生质体和葡萄叶肉原生质体在培养过程中一系列生理变化，发现原生质体再生难与氧化胁迫密切有关，活性氧水平和抗氧化系统决定了原生质体的再生能力，多胺可促进原生质体再生。在柑橘的研究中发现，柑橘叶肉原生质体再生受阻于细胞壁再生位点；柑橘愈伤组织与叶肉原生质体在培养过程中活性氧含量、抗氧化酶活性和抗氧化物质含量上存在差异，后者的氧化胁迫程度更高，抗氧化能力较弱。在细胞和分子水平上，以色列Graf i教授课题组经过10多年的努力在烟草原生质体有关研究中取得了重大进展。他们以可再生的烟草叶肉原生质体为试材，通过检测细胞核和染色质形态以及基因表达等方面的变化，发现分离后的烟草叶肉原生质体表现出类似动物干细胞的去分化状态，即染色质解凝聚、核仁与rRNA基因簇区域皱缩，TF基因大量表达。最近，Ondrej等(2009;2010)在培养可再生的黄瓜叶肉原生质体过程中也发现了染色质解凝聚的现象，还注意到抗坏血酸处理能降低氧化胁迫，促进染色质的再凝聚。这些结果表明，原生质体的再生一般都会经历染色质解凝聚过程。

二、原生质体再生植株的遗传变异及其利用

原生质体来自于植物的外植体，不经过有性过程。理论上，原生质体再生植株与供体植株在遗传和形态上应该一致(true-to-type)，但在很多植物原生质体再生植株中出现了一些与供体植株在遗传和形态上不尽相同的植株，这就是所谓的再生植株的变异，即原生质体无性系变异(protoclonal variation)，它是体细胞无性系变异的一种。产生这样的植株，有其优点也有其不足。一方面，就种性保持而言，产生变异的植株是不利的，因为它不利于供体材料原有性状和遗传特征的保留，尤其在以原生质体作为超低温保存的材料时，如果发生变异，则不利于材料的保存。但从另一方面看，产生变异为选择新优材料提供了可能，为品种选育提供了材料。

原生质体再生植株发生变异具有普遍性，并不限于某一种特定的植物，迄今为止，已在颠茄、水稻、猕猴桃、马铃薯、苜蓿、谷子、莴苣、烟草、甘蓝、番茄、柑橘、大麦、小麦、报春花、鄂报春、仙客来和矮牵牛等植物的原生质体再生植株中观察到变异(刘继红等，2003)，再生植株产生的变异主要有以下几个方面。

(一)染色体方面的变异

染色体变异在许多植物，如颠茄、马铃薯、甘蓝、柑橘、猕猴桃、水稻等原生质体再生植株中发生，变异类型主要有数目的改变和多核细胞的出现。Bajaj等在1978年就报道了在颠茄原生质体培养再生植株中发现染色体变异，在植株中出现了单倍体、多倍体和非整倍体。马铃薯原生质体再生植株细胞学检查发现，染色体存在不同倍性变化和非整倍性变异(李耿光等，1992; Jelenic等，2001)。熊新生等(1988)也发现在甘蓝原生质体再生植株中有二倍体、四倍体，同时也发现有部分非整倍体。何子灿等(1995)研究美味猕猴桃原生质体再生植株染色体数目时发现，再生植株染色体数目为142～310条，72.4％为非整倍体，六倍体占20. 7％，在有丝分裂的后期观察到染色体桥、染色体断片和落后染色体。分析变异来源，可能是发生在愈伤组织继代过程中或是发生在原生质体培养过程中。Prange等(2010)采用流式细胞仪检查了仙客来原生质体再生植株的倍性，发现约20％的原生质体来源的愈伤组织经再生得到四倍体植株。

(二)形态及农艺性状方面的变异

染色体的改变在一定程度上难以观察，但在形态和农艺性状方面的变化较为直接，因而对这两方面变异的研究更为普遍。在马铃薯嫩叶原生质体再生芽无性系中，叶形、叶色、叶柄长度、叶片大小、茎叶茸毛、节间长度、分枝情况、茎蔓长度以及生根和植株生长等均出现了较大的差异(李耿光和张兰英，1988)，甘蓝保卫细胞中的叶绿体数和形态结构上出现差异。番茄品种‘强丰’的原生质体再生植株在叶片形态上也出现了差异(范胜兰和马玉霞，1985)。美味猕猴桃原生质体再生植株最大的变异出现在叶片的形态上，不同的植株甚至同一株的叶片形态都有很大差异，节间和叶片长、宽以及叶柄长度都与母株有很大的差别(蔡起贵和柯善强，1992)。Lee等(1999)培养水稻原生质体再生出植株，但再生植株在叶片、花、小穗、花序与种子来源的植株有所不同，除上述形态特征外，两种类型的植株几乎在所有被评价的形态学特征中均表现出不同，有的形态学特征表现出显著的不同，如植株高度、旗叶长宽及其比例、花序特征(如花序长、主枝数和每花序小穗数)等。原生质体再生植株每花序种子数比种子来源的植株的要少得多，而且二者的种子在米粒长宽方面也表现出明显的不同。旱稻原生质体再生植株除了分糵数明显增多外，穗数也大大超过了对照株，穗枝数在原生质体再生株中差异较大，从穗实粒数和结实率来看，差异更显著，生长好的个别再生株最多的一穗可达到166粒，而有的植株却不结实，但总的结实率普遍低于对照株，同时还出现较多的空穗和瘪粒现象。

染色体变异与形态变异之间并无必然的联系，染色体发生变异的形态可能变异，也可能是正常，而形态发生变异的染色体可能是正常，也可能发生了变异。日本Ogura等(1987)报道，4个粳稻品种原生质体再生植株出现了田间性状和染色体的倍性变异。Fish等(1986)在马铃薯叶肉原生质体再生植株中发现，出现了36.4％的非整倍体植株，这些植株的高度与生长势下降，但同时发现部分植株发生了染色体结构变异，但形态与对照相似。在粳型水稻“77～170”品系原生质体再生植株中出现了形态变异的植株，但染色体分析表明均为稳定的二倍体。

(三)抗性方面的变异

Heinz等(1977)在800棵马铃薯原生质体再生植株中筛选到20株抗疫霉菌0号小种植株，Shepard等(1980),Meulemans等(1986)通过原生质体培养得到晚疫病抗性增强植株，这种抗性能通过无性繁殖或微繁殖传递给后代。Thomson等(1982)利用原生质体培养再生过程中产生的无性系变异，在其再生植株中筛选到PVX和PVY田间抗性增强植株。水稻原生质体培养再生植株中发现了高产和矮秆的植株。Sumaryati等(1992)在烟草原生质体培养再生植株中得到了耐盐和耐湿的突变体。柑橘原生质体培养再生植株中也获得了抗黑腥病突变体。此外，我国也从水稻原生质体培养再生植株中选出抗穗颈稻瘟病的植株(李向辉，1990)。

(四)其他方面的变异

由美味猕猴桃叶原生质体再生的植株存在性别分化，在已开花的美味猕猴桃原生质体再生植株中出现2个雌株和1个雄株(何子灿等，1997)。再生植株性别性状发生变异可能是性别控制基因或染色体发生结构性变异所致。猕猴桃胚乳原生质体培养的再生植株在性别表达、生长习性、生活力方面均出现了变异(Gui et al.，1993)。

(五)变异的原因及应用

导致原生质体再生植株发生上述变异的可能原因较多，有的认为是原生质体在培养过程中发生了25S rRNA或线粒体DNA突变，有的认为是原生质体培养在人工培养基中由于代谢过程与体内条件不完全相同，并且在培养时或在培养基中可能存在一些逆境使得基因表达不同，最终导致变异的产生。产生变异是获得新材料或有价值品种的一个前提，但变异能否稳定遗传则是这些品种能不能进一步利用的限制因素。虽然原生质体在培养过程中发生了体细胞无性系变异，但并不代表这些变异可以稳定遗传下去。此外，原生质体再生植株后代的群体变异系数较小，因为原生质体培养过程是一个筛选过程，只有少数细胞可以顺利再生成植株。原生质体再生植株变异程度与基因型、培养基中的激素和原生质体来源等因素的影响有关。例如，由马铃薯块茎分离的原生质体出现非整倍性变异的频率比叶肉原生质体再生植株高(Jones et al.，1989)。

在植物原生质体培养或融合再生的植株中出现变异植株在植物育种中有如下应用。首先，产生变异为选择新优材料提供了可能，为品种选育提供了材料，因为可以从原生质体培养产生变异的植株中选出有利用价值的材料已在马铃薯和水稻中取得成功。马铃薯‘Russet Burbank'原生质体再生植株中出现近千个变异类型，从中选出了2个或3个较有价值的品系(Shepard et al. , 1980)。日本选出的一个矮秆水稻新品种‘世锦’就是水稻原生质体培养产生的变异，与对照相比，变异品种增产10％。其次，由于原生质体培养再生植株变异是在培养过程中发生的，不需经过其他的特殊的操作和选择，因此，能够缩短育种年限、节约时间、加速育种进程。例如，阳体冰等(1991)报道从水稻原生质体再生植株R₁到R₄的培育和选择只需要3年，而常规育种育成新品种则需要5年，釉粳杂交育种需要8～10年。再次，在现有研究条件下，通过酶解法能够分离得到大量的原生质体，使得变异发生面广、幅度高、整齐度高而且稳定快，因而可以获得大量的变异材料。例如，Shepard等(1980)在马铃薯栽培品种‘Russet Burbank’叶肉原生质体再生植株中观察到很多变异类型，因而可以用于选择的材料也就增多。

自酶解法获得大量原生质体以来，有关原生质体的研究层出不穷，涉及的植物数目不断增加，研究的层次也在逐步深入，原生质体融合研究已逐渐到了能够应用于植物改良的时候，原生质体操作在作物遗传改良中显出巨大的应用前景。然而，在乐观的同时，我们必须清楚地看到，原生质体培养和融合以及获得的新材料在农业上的应用还需一定的时日，同时，一些植物原生质体培养和融合未能取得成功，获得的体细胞杂种还未有真正的应用，这都需要在今后的研究中不断探索。