原生质体培养的前提之一是获得大量有活力的原生质体，如第一节所述，原生质体分离(价otoplast isolation)方法较多，但现在用得最广的是酶解法，本节主要对酶解法分离原生质体进行介绍。

一、原生质体分离

(一)外植体来源

生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物(suspension culture)、原球茎、原丝体、花瓣和叶表皮等。其中植物幼嫩的叶片、萌发种子的胚轴、子叶、愈伤组织和悬浮培养物等均是原生质体的良好来源，尤其是叶片，因为从叶片中一次可以分离出大量均匀一致的细胞。培养的愈伤组织和悬浮细胞系由于其生长快速稳定，受环境条件的影响不大，容易获得大量高质量的原生质体。

(二)取材

叶片可以取自田间、温室或光照培养箱中生长的植株，也可以取自试管苗(in vitro seedling)，但以后者为佳，因为田间或温室生长植株的叶片在分离原生质体前要进行灭菌。如果是试管苗，一般在叶片充分展开时取材较好。愈伤组织和悬浮细胞取材通常在细胞生长的对数期，前者一般在继代培养的10～20d，后者在继代培养的3～7d。但是长期培养的愈伤组织和悬浮细胞容易丧失再生能力，并且较容易发生体细胞无性系变异。因此，在这两类材料继代到一定时间后，应在固体培养基上再次选择具有再生能力的颗粒状胚性愈伤组织。同时，每次继代愈伤组织和悬浮细胞时应注意选择胚性细胞团转移到新鲜培养基中，以尽量减少出现变异细胞。

（三)酶液组成和浓度

用来分离植物原生质体的酶制剂主要有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和离析酶等，酶解花粉母细胞和四分体小抱子时还要加入蜗牛酶。纤维素酶的作用是降解构成细胞壁的纤维素；果胶酶的作用是降解连结细胞的中胶层，使细胞从组织中分开以及细胞与细胞分开。有的植物只采用纤维素酶和果胶酶就能够分离出原生质体，但有的植物和材料要添加半纤维素酶或离析酶才能得到较多的原生质体。

常用的酶制剂及其生产厂家有：纤维素酶Cellulase Onozuka R-10 (Kinki Yakult Manuf. Co. Ltd. ,Nishinomiya，日本)、Cellulase Onozuka RS (Kinki Yakult Manuf.Co. Ltd. , Nishinomiya，日本)、Cellulase Worthington (Worthington Biochemical, Lake-wood, NJ，美国)、Cellulase (Sigma), Driselase (Kyowa Hakko Kogyo Co.，日本)；果胶酶Pectolyase Y23 (Kikkoman Shoyu Co., Lte.Nishinomiya，日本)、Macerozyme(Yakult Biochemicles Co.，日本)、Pectinase (Serva)等；半纤维素酶有Rhozyme Hp-150(Rohm and Haas Co.inde．美国宾夕法尼亚州)。

表6-2为几种作物原生质体分离的酶液组成，从表中可以看出，不同植物用于分离原生质体的酶液浓度可能不同，有的纤维素酶浓度高，有的果胶酶浓度高。大多数植物分离原生质体时纤维素酶浓度为1％～3％、果胶酶为0.1％～1％，但也有很多例外。例如，在苎麻原生质体分离的酶液中，纤维素酶浓度高达6％。同时，同一植物不同基因型或者不同外植体所用酶的种类和浓度也会不同。例如，在药用植物中，一般来说幼嫩的叶片去壁相对容易，1％～2％的Cellulase Onozuka R-10,2％左右的Macerozyme添加少量的Driselase就可以达到要求，而愈伤组织和悬浮细胞则需要活性较强的酶和较高的酶浓度，如Cellulase Onozuka RS, Pectolyase Y23、Rhozyme等。

表b-2一些作物所用的酶解溶液

注：Ⅰ为小麦悬浮细胞；Ⅱ为水稻悬浮细胞；Ⅲ为玉米悬浮细胞；Ⅳ为柑橘悬浮细胞。

在配制酶液时通常加入一些化学物质，以提高酶解效率或增强酶解原生质体的活力。酶液中添加适量的CaC1₂·2H₂O, KH₂PO₄或葡聚糖硫酸钾(dextran sulfate potassium)有利于提高细胞膜的稳定性和原生质体的活力，加入2-(N-吗啉)一乙基磺酸[2-(N-morpho-lino) ethanesulfolic acid, MES]可稳定酶液的pH，加入牛血清蛋白(bovine serum albu-min, BSA)能够减少酶解过程中细胞器的损伤。酶液pH一般在5.6～5.8，过高或过低均不适于原生质体分离。酶液配好后不能进行高温灭菌，只能采用微孔滤膜过滤灭菌，常用的微孔滤膜孔径有22um和45um，一般先用45um的滤膜过滤，再用22um的滤膜过滤一次，以保证能够将细菌全部滤去。

原生质体由于没有细胞壁的保护，对外界环境条件中的渗透压较为敏感，如果酶液的渗透压与细胞内的渗透压相差过大，则容易导致原生质体收缩或膨胀，最终导致原生质体的死亡。因此，在酶液中应保持一定的渗透压，达到该目的的方法是使用渗透压调节剂(os-moticum)，常用的物质为一些糖或糖醇，如葡萄糖、果糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇等，浓度在0.6mol/L左右，此外采用盐溶液也能起到调节渗透压的目的。

(四)酶解条件

酶解过程一般在25～28℃条件下进行，通常采用混合酶液一步完成。植物材料与酶解液按一定比例混合，有时还要加入培养基。某些材料需要放在低速摇床上，以保证材料能够酶解充分。在酶解时应尽量避光，尤其是强光照。酶解时间从几小时到十几小时，依不同植物和不同外植体而定。但如果原生质体在酶液中的时间过长，对其活力和以后的生长发育不利，因此一般酶解时间尽可能短(2～6h)，多数植物的酶解时间不超过24h。在酶解过程中要经常进行观察，当看到有大量的原生质体时，即可停止酶解，转入纯化工作。

值得提出的是，现在已有不少研究者试图寻找简单有效的原生质体分离方法，并已取得了初步成功。Aoyagi和Tanaka (1999)发展了一种简单的原生质体分离方法，将植物细胞(如悬浮系愈伤组织)进行排气处理，然后将处理的细胞与藻酸钠滴入含有分离原生质体的酶液中，原生质体分离和胶的固化同时进行，此法可以明显缩短时间，而且原生质体的活力较高。最近，Wu等(2009)发展了一种“胶带一拟南芥三明治”的叶肉原生质体分离新方法，使用两种胶带分别粘在分离叶片的上下表皮，将下表皮揭去后再进行酶解，此法既缩短时间，又大大提高了原生质体的产量。

二、原生质体纯化

植物材料与酶解液混合后，得到的产物为原生质体、多细胞团、未酶解的组织和细胞碎片。如果此时直接将这样的材料进行培养，结果不会理想，必须进行原生质体纯化(protoplast purification)，以去掉酶液，并且除去未酶解的组织和碎片以及多细胞团，才能进行培养。

酶解的原生质体产物首先通过不锈钢网或尼龙膜过滤，通常是双层钢网，孔径分别为400目和200目，过滤时要加入一些培养基进行清洗，常用的原生质体清洗培养基为Coc-king教授等采用的CPW盐溶液，其成分为KH₂PO₄ 27.2mg/L, KNO₃ 101mg/L, CaC1₂·2H₂O 1480mg/L, MgSO₄·7H₂O 246mg/L, KI 0.16mg/L, CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，pH5.6。在滤液中主要是原生质体，然后采用上浮法和下沉法两种纯化方法。上浮法是将酶解的原生质体与蔗糖溶液(23％左右)混合；下沉法是先将原生质体与13％的甘露醇混合，然后加到23％的蔗糖溶液顶部形成一个界面。两种方法中均在100×g下离心5～10min,会在蔗糖溶液顶部形成一条原生质体带。用吸管将带轻轻地吸出来，用培养基悬浮离心，然后稀释到10⁴～10⁵个／mL,用于培养。

三、原生质体活力测定

原生质体培养前通常要进行活力(viability)检查，以便知道其状态是否正常。测定原生质体活力的方法主要有观察胞质环流(cytoplasmic streaming)、测定呼吸强度和FDA染色，其中最常用的是FDA法。FDA是荧光素双乙酸酯(fluorescein diacetate, FDA),常用丙酮配置成2mg/mL溶液，在冰箱(4℃)中保存。FDA本身没有极性，无荧光，可以穿过细胞膜自由出入细胞，在细胞中不能积累。在活细胞中FDA经酚酶分解为荧光素，后者为具有荧光的极性物质，不能自由出入细胞膜，从而在细胞中积累，在紫外光照射下，发出绿色荧光。相反如果是死细胞，则不会发出绿色荧光。但是，荧光的强度受到细胞状态的影响。

四、影响原生质体分离的因素

虽然已有很多植物的原生质体分离取得成功，但并不是在任何情况下均能得到大量活力好、质量高的原生质体。原生质体分离受较多因素的影响，包括植物的类型、基因型、外植体类型及生理状态和酶液类型及浓度等。

(一)基因型和外植体

原生质体的产量很大程度上取决于基因型和外植体。基因型对原生质体分离好坏与否具有较大的影响，此方面的研究在甘蔗、香蕉等作物中均有报道。Assani等(2002)分离7个基囚型的原生质体，只有2个基因型原生质体分离效果较好。外植体影响原生质体分离表现为多方面，如外植体来源、外植体生理状态等。采用同样的酶液、同样的外植体，如果外植体来源不同，原生质体分离效果也可能不同。例如，酶液Cellulysin 1.0％+ Macerase0.5％能分离得到洋麻离体苗原生质体，但却不能分离出室外苗的原生质体。通常情况下，从叶片中容易分离到大量遗传上一致的原生质体，但有时产量偏低，在玫瑰、枣、中国李、苹果和野生杏等作物中发现，悬浮培养系分离原生质体的效果均比叶片和子叶好。来源于连续强光照下培养的试管苗原生质体的产量和质量都显著高于在弱光下培养的试管苗，在完全黑暗下培养的试管苗不能分离出原生质体。4℃、黑暗中预处理无菌苗有利于原生质体的分离。用于分离原生质体的外植体年龄影响分离效果，大麦幼苗分离原生质体时，生长5d的幼苗比生长4d和6d的幼苗容易分离原生质体。云南红豆杉(Taxus yunnanensis)产量与愈伤组织年龄有关，20d的愈伤组织产量最高。

采用某些手段对外植体进行预处理会影响原生质体的得率，如用 PEG处理甘蔗胚性愈伤组织可以成倍地提高分离原生质体的产量(林俊芳等，1996)。特定的预处理措施对得到大量有活力的玫瑰原生质体是必要的，如在预培养基中加入生长素、选用生长时期适合的悬浮系。

(二)酶液及酶解方法

很多研究表明，酶液成分、浓度和pH等均能影响原生质体的分离。通常情况下，酶液浓度越高，分离效果越好，但高浓度的酶液对分离出的原生质体具有一定的毒害作用，影响其活力。酶液浓度不高，但酶解时间过长也会影响原生质体的活力。因此，在酶解时应尽量避免高浓度的酶液与短酶解时间或低浓度的酶液与长酶解时间。此外，高纯度的纤维素酶(如cellulase worthington)能减少自由基的产生，可获得高活力的原生质体(Papadakis和Roubelakis-Angelakis, 1999)。酶液中一些附加成分对原生质体分离具有较大程度的影响。例如，有研究表明添加较高浓度的Ca²⁺有利于原生质体分离，加入抗氧化剂如[聚乙烯吡咯烷酮(PVP)]对原生质体的分离具有较为明显的促进效果，并且原生质体的活力也得到了增强。酶液pH也影响原生质体的分离。例如，娄和林等(1990)研究S种不同pH的酶液对樱草原生质体分离的影响，结果发现只有pH为5.6的酶液效果最好。再如，林俊芳等(1996)比较了三个甘蔗基因型胚性愈伤组织的原生质体分离，结果表明基因型之间存在着明显的差异。酶解的方法较多，不同方法之间原生质体分离的效果也会不同。酶解时将叶片放在真空进行渗透处理有利于原生质体分离。