(一)供体植株的生长条件

供体植株的生长条件对培养效果有重要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强的环境条件下，其花药才能有反应。不同植物种对环境条件的要求不同，所以没有一个固定的环境控制模式。在烟草中，短光周期(8h)和高光强(160001x)较有利。而对大麦，低温(12℃)和高光强(200001x)较好。芸薹属的一些种(油菜)，高光强和一定的温度变化较有利，对于甘蓝型冬油菜来讲，植株在15℃下生长比20℃下生长效果好。对烟草植株进行氮饥饿处理可以提高花药培养效果。大田和温室中生长的以及不同季节生长的玉米，在花药培养效率上有差异，应尽量使供体植株的种植标准化，即种在生长室或控温室里。最佳条件是：日／夜温度为25～30℃/18～20℃，16～18h光照，用高压钠灯补充光照，适当浇水和施肥，尽量避免使用杀虫剂。

(二)供体植株的年龄

有些物种供体植株的年龄影响小孢子胚胎发生，多数情况下幼年植株优于老年植株，但甘蓝型油菜却相反。Takahata等(1991)和Burnett等(1992)的研究发现，从老年的、看上去病弱的甘蓝和白菜型油菜分离的小孢子，比从幼年、健康植株上分离的小抱子有较高的胚产量。

(三)花粉发育时期

用于培养的花蕾，其花药内花粉发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一次有丝分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和芸4属中，单核早期最好。甘蓝型油菜单核小孢子最易形成单倍体胚，二核小孢子可能向培养基中分泌毒性物质，降低小孢子胚胎发生频率，并形成不正常和生长停滞的胚，油菜花粉发育时期对小孢子胚发育的影响见表5-3。

表5-3油菜(Brassica napus spp. Oleifera)花粉发育时期对小孢子胚诱导和生长的影响(Dixon, 1991)

诱导胚胎发生的最佳花粉发育时期因物种而异，一般从单核早期到双核早期。花药在接种以前，一般需先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗大小、颜色等特征之间的相应关系。可以根据花蕾和花药的长度判断花粉发育时期，从而为取材提供参考。一般而言，单核后期的花药培养较易成功，此时烟草花蕾的花冠大约与萼片等长。禾谷类作物则尚处于孕穗期。例如，水稻，此时的颖片通常已达最后大小，淡绿色，剥出的花药也呈淡绿色，如果花药白色则过嫩，黄色或黄绿色则偏老。对甘蓝型油菜来说，4.5mm以下的花蕾较适合于花药培养，花蕾、花药长度与花粉发育时期和培养效果的关系见表5-4。

表5-4油菜花蕾、花药长度与花粉发育时期和培养效果的关系(Polsoni et al,，1988)

a.每皿为5个花药得来的小孢子；b.固定一个花药进行细胞学观察。

(四)花蕾和花药的预处理

对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理能显著提高培养效果。例如，大麦花药，在4℃处理28d,或7℃处理14d能收到最好效果。4℃预处理被认为是小麦和大麦最合适的温度处理，而8℃预处理对玉米、水稻和甘蔗比较合适。在肌醇溶液中，10℃对大麦花药处理4d可以增强单倍体胚胎发生。可以对整穗、小穗，甚至分离的花药施加预处理，但应注意预处理期间不要与水接触以免污染。也有人将花药接种后放在低温下预处理。不同材料需不同的预处理方式，没有一个固定模式。除温度处理以外，其他一些因素的预处理有时也能收效，如用激素处理供体植株可以提高土豆花药单倍体的形成能力。用EMS、乙醇、射线、降低气压、调整渗透压进行预处理也有报道。

预处理有可能在小抱子培养的初始期打乱细胞骨架。研究发现，油菜小孢子培养的最初6～24h进行秋水仙素处理增强了小孢子胚形成的能力，使将要进行胚胎发生的小抱子细胞微管均匀分布，而没有诱导反应的小孢子微管呈极性分布。

(五)供体植株的基因型

供体植株的基因型是影响花药培养和花粉培养的关键因素，不同基因型的植株对培养的反应不同，表现为是否可诱导胚状体的生成、生成胚状体的多少以及由胚再生成植株的能力大小。大麦花药培养时胚形成能力在基因型间的差异可达60％以上。大麦、小麦和水稻的花药愈伤组织诱导率、绿苗再生率和每个花药的绿苗产量在不同的基因型间有很大差异。在油菜的花药培养中，冬油菜比春油菜易于获得小孢子胚，冬、春油菜的杂种1代具有很强的胚胎发生能力。花药培养的反应能力受主基因或多基因控制，而且可以向不具有反应能力的品种杂交转育。小麦的单倍体产量至少受三个独立的基因控制，在1D和5BL染色体上的基因影响胚胎发生频率。有些物种的细胞质基因对花药培养有一定影响。

遗传分析表明，在玉米花药培养中只有很少的基因参与单雄发育反应的决定，而且胚状体的形成和随后的植株再生没有关联，是由不同的基因决定的。单雄发育反应的加性遗传方差大于非加性遗传方差，即为数量性状遗传。

(六)培养基

究竟使用固体还是液体培养基应根据培养材料的要求而定。 MS培养基、N₆及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用得较多。花药培养时往往需要一定的渗透压，有的要求低浓度的蔗糖((20^o-40^o)，有的要求高浓度的蔗糖(8％～12％)。蔗糖对雄核发育的必要性最初是由Nitsch (1969)在对烟草的培养中发现的，后来又被Sunderland (1974)在培养南洋金花时所证实。虽然Sharp等(1971)曾报道，在完全不含蔗糖的培养基上烟草花粉也能发育成胚，但在这样一种简单培养基上发育只能进行到球形胚阶段。组织培养时蔗糖是必需的，但不一定总需要高浓度的蔗糖。在大麦花药培养中，Clapham (1971)最初使用12％的蔗糖，但后来发现并不需要这么高的蔗糖浓度，建议使用3％的蔗糖。不过在小麦组织培养时欧阳俊闻等(1973)发现，6％的蔗糖能促进花粉形成愈伤组织，但抑制体细胞组织的增殖。与此相似，根据能形成花粉胚的花药数判断，在马铃薯中6％的蔗糖也显著优于2％或4％的蔗糖。成熟花粉是2细胞结构的植物往往需低浓度糖，而成熟花粉为3细胞结构的植物往往需高渗条件。例如，油菜小孢子培养时糖的浓度为13％～17％。

培养基中激素的种类、使用量和配比对诱发小抱子启动分裂、生长和分化常常起决定作用，而其他成分一般只起次要的辅助作用。因此，在花药培养时进行细致的激素方面的实验是必要的。一旦筛选出比较合适的激素组合，会大大提高研究效率。在生长素中，2,4-D对许多作物花粉的启动、分裂、形成愈伤组织和胚状体起着决定性的作用。以不同浓度的2,4-D诱导小麦花药产生愈伤组织的试验结果表明，2,4-D浓度从0.2mg/L起，随着浓度提高，花粉愈伤组织出现频率有增高的趋势。但在几种釉稻花药培养中，当2,4-D的浓度增加后，其诱导频率反而降低，当2,4-D浓度增加到20mg/L时，‘珍珠矮’与‘平朝九号’都不产生愈伤组织。但应该注意的是，2,4-D对启动分裂和愈伤的增殖往往有刺激作用，但对分化却有抑制作用，在诱导单倍体愈伤分化时，应及时降低或去除2,4-D。有些植物可以不需要激素，如烟草、矮牵牛在无激素的培养基上可诱导单倍体胚胎发生。有些植物，如水稻、小麦等依赖于植物激素。

氮素的量和各种氮素的比例对培养效果有明显影响。朱至清等(1974)在水稻花药培养中证实，改变培养基中无机氮源可以显著改变花粉形成愈伤组织的频率，随后又影响由愈伤组织分化绿苗的频率。在他们所研制的N₆培养基中，供试的三个水稻品种花粉愈伤组织诱导率分别为37.7％,32.2％和7.5％，而在Miller培养基上分别只有15.5％,10.8％和0。N₆与Miller培养基中氮的组成有明显不同。中国科技工作者研制的N₆培养基为禾本科作物的花药培养作出了重要贡献。

有机物质在花药培养中可能起着重要作用。在大麦和小麦的花药培养中，谷氨酰胺对小孢子胚形成具有明显的促进作用。培养基中所添加的维生素对培养效果可产生重要影响，培养前应做条件试验。对于某些植物种来讲，添加某种植物的提取物或椰汁可以改善培养效果。3mg/L丙氨酸能大大提高釉稻和釉粳杂交后代愈伤诱导率和绿苗分化率，培养力平均可提高3.8倍。几种常用的禾本科植物花药、花粉培养的培养基见表5-5。

表5-5禾本科植物常用的几种花药、花粉培养基(Hu et al.，1999)

＊土豆培养基含10％土豆水提物。

有些作物的花药对培养基的pH有一定要求。在曼陀罗的花药培养中观察到，随着pH的变化产生胚状体的花药百分率增加，当pH达到5.8时效果最好，当pH增至6.5时花粉不形成胚状体，镜检发现花粉不发生细胞分裂。在油菜的小抱子培养中，通常采用6.2的pH效果较好。

培养基中添加乙烯抑制剂抑制乙烯的合成对B.oleracea的花药培养有利。Dias和Martins (1999)采用三种AgNO₃浓度对27种不同形态类型的B.oleracea进行花药培养研究，发现培养基中添加AgNO₃能显著增加大多数材料花粉胚的产量。可是大麦的花药培养正相反，培养的花药向培养基中释放乙烯达到一定程度可以刺激胚胎发生。对一些易产生酚类物质的植物，在培养基中加入活性炭可以吸附酚类及其他毒性物质，促进花药培养效果。

培养基中加入活性炭可以使烟草雄核发育的花药数由15％增加到45％。Bajaj等(1977)作了进一步完善，用2％的活性炭附加到培养基中，烟草雄核发育的花药百分率由41％增加到91％。而且每个花药产生的植株数量增加，并加速了从花药再生植株。0.5％的活性炭使玉米花药中愈伤组织或胚状体的诱导频率提高了3倍左右，在分化培养基上加入0.5％的活性炭，可使分化的幼苗健壮、根系发达。对活性炭提高雄核发育的机制了解甚少，可能是活性炭吸附了因高温消毒由蔗糖产生的5羟甲基糖醛，也可能是活性炭调节了内源和外源生长物质水平。

(七)培养条件

多数植物在25℃下培养能诱导愈伤组织，可某些植物，尤其是芸薹属植物在高温35℃下处理几天，然后放入25℃培养能收到最好培养效果。而玉米需要在14～15℃培养4d再转到27～28℃的条件下培养效果较好。花药培养一般在暗处进行，直到愈伤组织或胚状体形成后再转入光下培养。此外，接种花药的外植体的放置方向、培养密度等有时对培养效果也有影响。培养密度对花粉培养有较大影响，对花药培养似乎影响不大。甘蓝型油菜花粉培养胚胎发生的最低培养密度为3000粒花粉／mL，但若想获得最好的培养效果，密度需要达到10000～40000粒花粉／mL (Huang et al.，1990)。这种密度只在开始培养的几天重要，培养2d后将密度降到1000粒花粉／mL并不降低胚胎发生频率。

六、禾本科植物花药／花粉培养中的白化苗现象

禾谷类植物花粉单倍体生产中存在的一个严重问题是出现大量白化苗。水稻白化苗的产生与基因型和培养温度有密切关系，小麦白化苗产生的频率随温度增加而增加(25～35℃)低温处理对白化苗的产生因植物而异，较长时间的低温处理增加水稻白化苗的频率，但大麦正相反。单核花粉时期的花药在10℃处理3～14d可以产生90％的绿苗和10％的白化苗，若低温处理到第21d，几乎所有植株都是白化苗。

白化苗的产生与很多因素有关，包括内部因素和外部因素。内部因素中，基因型和花粉发育时期的影响最为明显；外部因素中，如高温、高浓度2,4-D、延迟转分化培养时间等均可促进白化苗产生。关于白化苗产生的机制一直不甚清楚，可能是由于质体基因组的变异或来自染色体畸变的花粉，也可能是花粉在有丝分裂过程中质体不能分化并降解。

可以通过适当的调控措施降低白化苗的频率。颜昌敬(1996)总结了控制大麦白化苗产生的7条措施。

(1)对只分化白化苗或分化绿苗特别难的品种，可采用与高绿苗分化率的品种杂交，然后对F₁代进行花培，一般可改善和提高绿苗分化率。

(2)在田间条件下，用10.20mg/L 6-BA处理大麦花药。

(3)取花粉发育时期处于单核早、中期的大麦穗子。

(4)用约4℃低温预处理离体穗子2～3周。

(5)脱分化培养基中使用2,4-D配以少量2,4,5-T和6-BA，将碳源改为麦芽糖。

(6)提早进行花粉脱分化的转分化培养。

(7)诱导花粉细胞走胚胎发生途径可根本克服花粉白化苗的产生。