(一)单倍体植株再生

花药培养2～3周后，花药中的小抱子经大量分裂形成胚或愈伤组织，并逐渐使花药壁破裂，表面上看似乎从花药表面形成的突出物。烟草的花药在25～28℃的条件下培养1周，即可看到部分花粉粒膨大，但内部不积累淀粉。2周后，这类花粉粒进行细胞分裂，成为二细胞的“原胚”，并继续分裂形成多细胞的球形胚。随培养时间的延长，球形胚逐渐发育成心形胚、鱼雷形胚等。3周后，转到光下培养，胚状体见光由淡黄色转绿，并逐渐发育成小苗。并非所有植物的花药培养都遵循胚胎发生途径，许多种植物的花药在培养时并不形成胚状体，而由花粉分裂形成愈伤组织，然后在分化培养基上诱导形成芽、根器官，并形成植株。大部分禾谷类植物，如水稻、小麦、大麦、玉米等是通过器官发生途径产生单倍体植株的。单倍体胚萌发成单倍体植株往往需要特定的处理，才能获得较高的萌发率。例如，冬油菜获得单倍体胚后转移到几固体培养基上，在1℃处理14d可以达到70％以上的萌发率。

(二)单倍体植株鉴定

1．染色体直接计数法

通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。

2．间接鉴定

(1)扫描细胞光度仪鉴定(流式细胞仪)。主要测定叶片单个细胞中DNA的含量，确定细胞的倍性，材料的使用量可减少到1 cm²。

(2)细胞形态学鉴定法。叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。

(3)植株形态学鉴定法。单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。

(4)杂交鉴定法。自交或测交鉴定，看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞。

(5)分子标记鉴定。包括生化标记(如同工酶标记)和分子标记(如RFLP, RAPD,AFLP等)。

(三)单倍体植株加倍

单倍体植株由于染色体在减数分裂时不能正常配对，所以表现为高度不育。对单倍体进行加倍处理，使其成为双单倍体，是稳定其遗传行为和为育种服务的必要措施。在培养过程中，不同发育阶段的单倍体细胞可以自发加倍，但通常情况下，自然加倍率很低，通过人工加倍提高加倍频率是必要的。自发加倍的植株可以来自核内有丝分裂，也可来自于花粉核的融合。一般情况下，单倍体细胞在培养过程中是不稳定的，并有一种经核内有丝分裂(没有核分裂的染色体复制)形成二倍体细胞的趋势。这种趋势可能与培养基中的生长素有关。单倍体细胞的融合也可产生加倍植株，不同倍性水平花粉植株的存在充分说明这一机制的存在。

秋水仙素处理是诱导染色体加倍的传统方法，由于单倍体植株的产生经历离体培养、植株诱导与生长发育等多个时期，所以，诱导花粉植株加倍便可在各个时期实施。在烟草中一般使用0.4％的秋水仙素溶液。具体方法是：把幼小的花粉植株浸入过滤灭菌的秋水仙素溶液中96h，然后转移到培养基上使其进一步生长。秋水仙素处理也可通过羊毛脂进行，即把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部叶片的腋芽上，然后将主茎的顶芽去掉，以刺激侧芽长成二倍体的可育枝条。秋水仙素可以使细胞加倍，但它同时又是一种诱变剂，可以造成染色体和基因的不稳定，也很易使细胞多倍化，出现混倍体和嵌合植株。为解决这一问题，需要使处理植株经过一到儿个生活周期并加以选择才能获得正常加倍的纯合植株。一些研究人员认为，用秋水仙素处理单个单倍体细胞，如果处理的时间很短，可以降低混倍体和嵌合体的频率。如果单核小孢子在第一次有丝分裂之前被加倍，获得正常单倍体的频率便会增加。Za-mani等(2000)在进行小麦花药培养之前，首先在含有0.03％秋水仙素的诱导培养基里于29℃条件下对花药培养3d，然后将其转移到不含秋水仙素的新鲜培养基里于同样条件下继续培养，获得了大量的可育植株。可见，秋水仙素处理时要注意处理的时间和剂量。对不同的组织、细胞，不同的发育阶段，在处理方式上可能需要适当的调整。

氟乐灵(trifluralin)是一种植物特异性微管形成抑制剂，也可使染色体加倍。Zhao等(1995)的研究发现，用氟乐灵处理分离的甘蓝型油菜小抱子，30min后微管解聚，用秋水仙素则需要处理3～8h。而且使用氟乐灵比使用秋水仙素产生的不正常胚率低。在甘蓝型油菜小孢子培养最初的18h用lumol/L或10umol/L氟乐灵处理被认为是最好的获得双单倍体的方法。秋水仙素和氟乐灵加倍效果的比较见表5-1。

表5-1秋水仙素和氟乐灵处理油菜(Brassica napus cv. Topas)小孢子培养物对胚胎发生频率和再生植株育性的影响(Zhao et al.，1995)

a。实验的平均胚胎发生率，括号中数字为变化范围。

b．再生植株数用括号中数字表示。

c．为没有用药品处理的对照(洗涤和持续处理)的总数字。

*具有不同程度不正常胚的处理。

二、花粉培养与花药培养的比较

(一)花粉培养与花药培养的比较

花药培养与花粉培养有共同点，也有差异。其共同点表现在：二者培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。其差异表现在：从概念来看，花药离体培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花药内花粉粒的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株；花粉离体培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术，由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育而成的植株都是单倍体，且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰。从培养层次来看，花药离体培养属器官培养，花粉离体培养属细胞培养，但花药离体培养和花粉离体培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。从培养过程来看，花药离体培养相对较容易，技术比较成熟，但最后需要对培养成的植株进行染色体倍数检测；花粉离体培养尽管不受花药壁、药隔等二倍体细胞的干扰，但这种特殊单倍体细胞的培养技术难度较大，目前只在少数植物上获得成功。

花药培养与花粉培养的区别见表5-2。

表5-2花药培养和花粉培养比较

(二)花粉培养的优越性

花粉培养在某些方面比花药培养有一定优势。①花药培养有时会由于花药中的有害物质而不能诱导花粉小孢子启动第一次分裂，花粉培养则不存在这一问题。②花药小孢子已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含有因药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株。③由于起始材料是小孢子，获得的材料总是纯合的，不管它是二倍体还是三倍体；花药培养可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程，是一个很好的遗传与发育研究的材料体系。④由于小孢子能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，是研究吸收、转化和诱变的理想材料。