牛磺酸是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，是一种维持人体自然生长和正常人体机能所必需的水溶性维生素。牛磺酸能促进婴幼儿脑组织和智力发育，提高神经传导和视觉机能，防止心血管病，改善内分泌状态，增强人体免疫能力，改善记忆等药物用途；同时作为化妆品原料，牛磺酸具有赋活肌肤细胞的能力，可源源不断地提供年轻肌肤快速与持久的能量补充与多重保护；牛磺酸还具有提高肌肤免疫力，抵抗外界环境对肌肤的侵袭的功效。国家标准对婴儿食品、牛磺酸添加剂有相关要求［1，2］。

研制具有准确纯度及不确定度水平的牛磺酸纯度标准物质，对食品检验及国家量值溯源能力具有重要意义。为此笔者根据国际标准化组织ISO导则35［3］及JJF1343–2012标准物质定值的通用原则及统计学原理［4］研制了牛磺酸标准物质。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

超高效液相色谱系统：ACQUITYUPLCTM型，配有ESABiosciencesCoronaCAD检测器，美国Waters公司；傅里叶变换红外光谱仪：ThermoScientificNICOLETiS10型，美国Thermo公司；热重分析仪（TGA）：Pyris1型，Perkin–Elmer公司；电感耦合离子体质谱仪（ICP–MS）：Agilent7500c型，美国Agilent公司；毛细管电泳仪：P／ACEMDQ型，美国Beckman公司；牛磺酸：瑞士Fluka公司；乙腈：色谱纯，德国Merck公司；实验所用其它试剂为分析纯；实验用水为二次去离子水。

1.2原料获得及标准物质

牛磺酸候选物经理化特性测试后进行定性分析确定主体成分，初步确定其纯度在99％以上，均匀性初检合格后分装到事先清洗、干燥的棕色小玻璃瓶中，每瓶200mg，共300瓶，冷藏（4℃）下储存。

1.3定性分析

采用红外光谱法对牛磺酸标准物质主成分进行定性分析。

1.4定值分析

采用超高效液相色谱（UPLC）法与高效毛细管电泳（HPCE）法两种不同原理的方法对牛磺酸标准物质进行定值分析。

1.4.1超高效液相色谱法

WatersACQUITYUPLC®BEHAmide液相色谱柱（100mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：A相（超纯水）–B相（乙腈）（体积比为20∶80），等度洗脱；流速：0.45mL／min；进样量：10μL，样品为50μg／mL牛磺酸溶液（溶剂为流动相）；检测器：ESABiosciencesCoronaCAD质量型检测器；保留

时间：2.74min；样品：配制牛磺酸的流动相比例溶液50μg／mL，每样品进2～3次。空白进样2次。

1.4.2高效毛细管电泳法

毛细管：永年锐沣色谱器件有限公司石英毛细管（40.2cm×50μm）；分离缓冲液：360mmol／LNa3PO4+0.5mmol／L十六烷基三甲基溴化铵；样品介质：将分离缓冲液稀释10倍；分离电压：–4kV；进样浓度：10mg／mL；进样时间：15s；进样压力：3.45kPa（0.5psi）；检测波长：200nm。

1.4.3其它分析方法

水分和挥发性物质采用热重分析法（TGA）进行测定，灰分测定依据GB／T9741–1988《化学试剂灼烧残渣测定通用方法》测定灼烧残渣，无机元素测定基于DZ／T0223–2001电感耦合等离子体质谱（ICP–MS）分析方法通则，采用FinniganMAT的HR–ICP–MS进行分析测定。

2结果与讨论

2.1定性分析

图1为牛磺酸的红外光谱图，与日本AIST标准图谱［5］一致，可以确定样品为牛磺酸。

2.2定值分析

2.1.1超高效液相色谱法

采用超高效液相色谱法测定牛磺酸的纯度，结果见表1，色谱图见图2。

2.1.2高效毛细管电泳（HPCE）法

采用高效毛细管电泳法测定牛磺酸的纯度，结果见表1，牛磺酸毛细管电泳图见图3。

2.1.3定值结果

首先对选用的两种定值方法进行一致性检验，一致性检验原则是对两种方法定值结果进行F检验和t检。如果等精度则定值结果按式(1)计算：

如果不等精度，但结果相近（F检验不通过，t检验通过），则按式(2)计算：

因此，一致性检验通过，定值结果按照等精度要求进行计算,按照式(1)计算得两种方法的定值结果：y=99.6%。测得的其它杂质含量均小于0.1%，对定值结果

影响较小，故忽略不计。

2.1.4均匀性检验

采用瓶间均匀性评估方案一进行标准物质的均匀性检验：从全部样品（300瓶）中随机抽取15瓶，每一瓶取3个子样，每个子样测定3次，用液相色谱法进行测定。采用均匀性评估统计模式——单因素方差分析法来判别样品的均匀性［3］。

由此可知，该统计量是自由度为（v1，v2）的F分布变量。根据自由度（v1，v2）及给定的显著性水平α，可由F分布临界值表查得临界的Fα值。若F值有F<Fα，则认为数据组间无明显差异。均匀性检验结果见表2。

2.1.5稳定性考察

按先密后疏的原则，在一定时间间隔内，采用液相色谱法检测在规定条件下保存的标准物质纯度随时间的变化情况。短期稳定性：将牛磺酸样品置于常温储存条件（最低要求的运输条件），分别进行7，15，30d的稳定性监测。每次取6个包装，每个包装取一个子样，重复测量3次，计算平均值，把5个包装测量结果平均值作为检测结果。长期稳定性：将牛磺酸样品置于低温（4℃）储存条件，分别在第1，3，6，12个月进行稳定性监测。采用同步稳定性考察牛磺酸标准物质的短期稳定性和长期稳定性。采用均匀性检验法考察数据有无显著变化趋势。采用经验线性模型对其稳定性进行评估［3］，以X代表时间，以Y代表牛磺酸的纯度，进行线性拟合。

比较a与t0.05,n–2sa的大小，如果a＜t0.05,n–2sa，则说明斜率不显著，标准物质稳定。长期和短期稳定性检测结果见表3。

数据表明牛磺酸标准物质量值在分析值的不确定度内且无显著的变化趋势，由于其动力学机制未知，因此选择经验线性模型对其稳定性进行评估。以X代表时间，以Y代表牛磺酸的含量，进行线性拟合，牛磺酸标准物质的稳定性考察结果的线性拟合和统计参数见表4。

由表4数据可知，牛磺酸标准物质的稳定性是可靠的。

3定值结果的不确定度评定

3.1定值过程产生的相对不确定度uc

3.1.1液相色谱法引入的相对不确定度uLC测量重复性引入的相对不确定度（A类标准不确定度）u1=0.09%，B类不确定度可忽略，故：uLC=0.09%

3.1.2高效毛细管电泳法引入的相对不确定度uCEA类标准不确定度：高效毛细管电泳法测定时精密度引入的相对不确定度u2=0.11%。B类标准不确定度：样品称量引入的相对不确定度u3=0.15%；容量瓶引入的相对不确定度u4=0.0021%；温度变化引入的相对不确定度u5=0.061%。

故HPCE法引入的相对不确定度：

两种方法均通过了一致性检验，因此按照等精度方法计算不确定度。

3.1.3其它杂质引入的相对不确定度

根据无机元素、灰分、水分与挥发性物质测定的结果，由于其含量小于0.1%，其不确定度可忽略。故定值过程引入的相对不确定度：

3.2均匀性与稳定性引入的相对不确定度

均匀性不确定度计算方法参见JJF1343–2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》，计算出瓶间均匀性不确定度ub。稳定性不确定度分为长期稳定性引入的不确定度uL与短期稳定性引入的不确定度uS，根据稳定性评定过程中的sa稳定性引入的相对不确定度：

U=sXa

牛磺酸标准物质的均匀性与稳定性引入的不确定度见表5。

3.3牛磺酸标准物质不确定度结果

标准物质定值结果的相对不确定度：

取k=2，牛磺酸标准物质的相对扩展不确定度：

研制的牛磺酸纯度标准物质定值结果为99.6%，相对扩展不确定度为0.5%（k=2）。

4结语

研制了牛磺酸标准物质，对其进行了均匀性检验、稳定性考察，考察结果表明该标准物质符合标准物质均匀性与稳定性的要求。研制的标准物质对于食品中牛磺酸的准确测定具有重要意义。